亞臨界丁烷制備豆粕及其蛋白氧化穩定性研究

朱樂平 楊曉泉

(華南理工大學輕工與食品學院 食物蛋白工程研究中心，廣州 510640)

亞臨界丁烷制備豆粕及其蛋白氧化穩定性研究

朱樂平 楊曉泉

(華南理工大學輕工與食品學院 食物蛋白工程研究中心，廣州 510640)

采用亞臨界丁烷對大豆粉脫油制得豆粕(DSF-B)，并與正己烷制備豆粕(DSF-H)比較，對分離蛋白得率及熱變性、豆粕殘余極性脂和在貯藏過程中蛋白的氧化進行分析。DSF-B的蛋白得率(32.1%)比DSF-H高(約6%)，蛋白熱變性二者一致,且11S變性溫度低于工業白豆片。殘余極性脂分析，DSF-B比DSF-H總量低、磷脂含量高，脂肪酸組成有差異。模擬貯藏試驗表明，DSF-B在貯藏中蛋白更易被氧化，這可能與極性脂的組成有關。亞臨界萃取技術無高溫處理、可選溶劑多樣，可開發應用于大豆等植物蛋白制品。

亞臨界丁烷 正己烷 豆粕 蛋白氧化

豆粕是大豆提取豆油后的副產品。它含有45%左右的蛋白質，氨基酸種類齊全，除蛋氨酸含量較低外，其余必需氨基酸含量均比較豐富，且含有大豆磷脂、大豆異黃酮等生物活性物質，營養價值高。作為優質植物蛋白原料，豆粕被廣泛應用于畜禽飼料和商用脫脂大豆蛋白產品。但豆粕在生產及貯藏過程中，受加工方式、外部環境及水分、脂質、酶等因素影響，質量發生劣變，蛋白隨之受到誘導變性，蛋白氧化是主要形式之一，嚴重降低其營養價值。

亞臨界萃取技術是近20年發展起來的一項新的萃取分離技術[1]。在萃取過程中，萃取劑溫度高于其沸點、始終為液態，利用相似相溶原理，萃取生物原料中的脂類物質。它的主要優點是低溫工藝，不會對熱敏性成分造成損害，目前已在精油、色素、植物油、藥材等幾十種植物原料脂溶性和水溶性成分的分離提取中得到應用[2]。同時，有研究報道植物油料應用亞臨界丙烷和丁烷萃取工藝，保證了粕中植物蛋白等成分不變性[3]。以大豆為代表的食用油生產中，國內外大多采用正己烷作為浸出溶劑，工藝中的熱處理會破壞油料中的有用成分，并且正己烷對神經系統有一定的毒性，人們已提出質疑并期望找到可替代溶劑。

對亞臨界萃取技術的研究，目前主要集中在油脂、天然活性物質等有關成分的分離提取方面，對粕和蛋白的研究鮮見報道。本試驗采用亞臨界丁烷萃取技術制備豆粕，并與傳統的正己烷制備豆粕進行比較，分析分離蛋白得率及熱變性、豆粕殘余極性脂和在貯藏過程中蛋白的氧化變性，以期為亞臨界萃取技術中副產品的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大豆和白豆片，市售；亞臨界丁烷：廣州深巖燃氣有限公司；其他試劑為分析純或色譜純。

亞臨界流體萃取裝置：珠海共同機械有限公司；DYF-500搖擺式高壓萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；KDN-102C定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；CR22G高速冷凍離心機：日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機：德國Christ公司；SevenEasypH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV2300紫外-可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；Nano示差掃描量熱儀：美國TA公司；GC5890-MS5975氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫脂豆粕的制備

亞臨界丁烷萃取：大豆經清理除雜、粉碎，過30目篩，萃取壓力0.4 MPa、溫度40 ℃、時間30 min，重復3次。然后鋪成薄層置于通風廚，并定期翻動，干燥24 h粉粹過60目篩。

正己烷浸提：大豆經清理除雜、粉碎，過60目篩，加入4倍體積正己烷浸提脫脂，溫度40 ℃、時間30 min，重復3次。然后鋪成薄層置于通風廚，并定期翻動，干燥24 h過60目篩。

1.2.2 分離蛋白的制備

脫脂豆粕經堿溶酸沉提取蛋白，采用Zheng等[4]的方法。

蛋白得率=(提取的蛋白干重/脫脂豆粕干重)×100%。

蛋白回收率=(提取的蛋白干重×蛋白含量)/(脫脂豆粕干重×豆粕蛋白含量)×100%。

1.2.3 豆粕主要指標測定

蛋白含量：參考GB/T 5009.5—2003，微量凱氏定氮法[5]。蛋白含量=含氮量×6.25。

極性脂含量：參考GB/T 2677.6—1994[6],用索氏抽提法測定極性脂含量,抽提溶劑為氯仿-甲醇(2∶1，V/V)。

極性脂含量(干基)=(極性脂質量/試樣干重)×100%。

1.2.4 分離蛋白熱變性測定

采用Meng等[7]的差示掃描熱量法(DSC)。將約2 mg樣品和10 μL、50 mmol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液密封于鋁盤中，以空白鋁盤作對照，將樣品以10 ℃/min加熱速率由20 ℃加熱至120 ℃。

1.2.5 豆粕殘余極性脂分析

殘余極性脂提取：稱取豆粕3 g，加入15 mL氯仿-甲醇(2∶1，V/V)，室溫攪拌萃取30 min，10 400 r/min離心10 min取上清液備用，測脂肪酸和磷脂組成。

氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)：取適量上清液，氮吹除去溶劑，采用GB/T 17376—2008[8]酯交換法進行甲酯化。氣相色譜條件：色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.5 μm)，進樣口溫度250 ℃，載氣流速(He)1.0 mL/min，進樣量2.0 μL，分流比50∶1。采用程序升溫，柱初溫100 ℃，以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min。離子源EI 70 ev，掃描范圍50～450 amu。用面積歸一化法確定各成分的相對含量。

薄層層析(TLC)：取上清液20 μL點到硅膠H薄層板上，用氯仿/甲醇/冰醋酸/水(85∶15∶10∶3，V/V)混合液展開，取出，晾干，碘蒸氣顯色。

1.2.6 模擬貯藏豆粕

2種豆粕各取適量，均分為2份。各取1份100 ℃干熱處理20 min。將4份豆粕(干熱處理與未處理各2份)鋪成薄層置于35 ℃密閉水浴鍋吸收水分2 h，提高含水量。將上述豆粕放入密封瓶中，置于60 ℃烘箱存放，分別于第1、2、4、6天取樣，4 ℃保存備用。進行一次重復試驗。

1.2.7 豆粕蛋白的氧化指標測定

溶解度：精確稱取0.02 g樣品于消化管，參考GB/T 5009.5—2003微量凱氏定氮法[5]測定總氮含量；再精確稱取0.35 g樣品于20 mL去離子水中，室溫下攪拌溶解1.5 h，以10 000 r/min離心20 min，取上清蛋白液5 mL于消化管，沸水浴濃縮至稠狀物，按微量凱氏定氮法[5]測定可溶性氮含量。

蛋白含量=含氮量×6.25。

溶解度=(上清液中的蛋白含量/樣品蛋白含量)×100%

羰基含量：取上述測溶解度的上清蛋白液，根據Huang等[9]的方法測定羰基含量。以上清液中每g蛋白所含μmol計。

自由巰基含量：精確稱取0.35 g樣品，加入20 mL、0.1 mol/L、pH 8.0磷酸緩沖液，該磷酸緩沖液含有l mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)和1% SDS(十二烷基硫酸鈉)，室溫下攪拌溶解1 h。以10 000 r/min離心20 min，取上清蛋白液。根據Huang等[9]的方法測定自由巰基。以每g豆粕蛋白所含μmol計。

1.3 數據分析

利用SPSS 11.7和OriginPro 8軟件進行數據統計分析及作圖，數據以均值±標準差(Means±SD)表示，顯著水平為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 豆粕主要成分

如表1所示，以市售WF作參照，DSF-B與DSF-H的蛋白含量和極性脂含量與之相近。DSF-B的極性脂含量比DSF-H略低，殘余極性脂是影響豆粕品質和引起蛋白氧化變性的主要因素。

表1 豆粕主要成分(干基)

注：DSF-B和DSF-H分別是大豆采用亞臨界丁烷(Butane)萃取和正己烷(Hexane)浸提脫油，制得脫脂豆粕(Defatted soybean flour)，WF是市售白豆片(White flakes)。

2.2 蛋白質得率和回收率

蛋白得率的高低與生產大豆蛋白企業的經濟效益直接相關，其變化范圍一般為20%～30%[10]，DSF-B蛋白得率為32.1%，比DSF-H高(約6%)。二者蛋白含量接近，故DSF-B的蛋白回收率相應比DSF-H高(圖1)。

注：SPI-B、SPI-H及WF SPI分別是從DSF-B、DSF-H及WF提取的分離蛋白。

圖1 3種豆粕的蛋白得率及回收率

2.3 分離蛋白的熱變性

圖2顯示3種蛋白的7S和11S組分都有明顯的特征吸收峰，說明蛋白變性程度低。表2列出了11S組分變性的起始溫度(Tm)、峰值溫度(Td)及焓變(ΔH)，可知SPI-B與SPI-H的11S組分變性溫度比WF SPI低。由于DSF-B與DSF-H采用自然干燥脫溶，全部處理溫度最高僅為40 ℃，而市售WF目前常采用閃蒸脫溶和臥式脫溶，有不同時間的高溫處理(閃蒸脫溶約2 s，臥式脫溶10～15 min)[11]，蛋白結構更加穩定，使其熱變性需要更高溫度，所以可能導致SPI-B與SPI-H的11S組分變性溫度比WF SPI低，具有較差的熱穩定性。

圖2 分離蛋白的DSC圖譜

樣品Tm/℃Td/℃ΔH/J/g蛋白質SPI-B86.4±0.791.9±0.64.5±0.8SPI-H86.3±0.392.0±0.46.1±0.8WFSPI88.7±0.894.9±0.66.2±0.2

2.4 豆粕殘余極性脂分析

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸是大豆中含量最多的5種脂肪酸，占出峰物質的99%以上[12]。從表3可見，脂肪酸含量高低順序均依次為亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞麻酸，但其相對含量有一定的差異。DSF-B的亞油酸和亞麻酸相對含量比DSF-H略高，而油酸含量明顯低于DSF-H。大豆中豐富的脂肪氧合酶能催化含1，4-順，順-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)，發生脂質過氧化反應，產生的自由基、脂質氫過氧化物及活性醛類會使蛋白發生共價修飾，造成蛋白氧化[13]。

圖3 極性脂的氣相色譜圖

峰號化合物相對含量/%DSF-BDSF-H1棕櫚酸27.125.72硬脂酸5.24.63油酸6.911.74亞油酸56.754.35亞麻酸4.03.7

殘余極性脂含量DSF-B為3.90%，DSF-H為4.38%(見表1)。TLC分析表明(見圖4)，2種豆粕含有磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂 (PC)，磷酯酰肌醇(PI)等磷脂，磷脂的含量和組成不同。圖4可知，L是商業卵磷脂，從上至下3個主要組分依次為PE、PC、PI[14]，可以看出DSF-B中磷脂含量較高，主要表現在PC較多。這是因為，丁烷比正己烷對磷脂的浸出量少，DSF-B殘余的磷脂相應多。

圖4 極性脂的TLC分析圖

2.5 貯藏過程中蛋白的氧化評價

豆粕在貯藏過程中，水分、殘余脂質、脂肪氧合酶等將導致其質量劣變，蛋白氧化隨之發生。脂肪氧合酶在60 ℃左右有一個激活態，酶被激發出更高的活力[15]。試驗中為了較快分析豆粕在貯藏中蛋白的變化，貯藏前使豆粕吸收水分成為高水分豆粕，溫度采用60 ℃，以構建一個高溫高濕環境模擬加速氧化。同時對經過100 ℃干熱處理20 min的豆粕進行試驗。貯藏1、2、4、6 d后，分別對蛋白溶解度、羰基和自由巰基進行測定。

2.5.1 溶解度變化

溶解度在一定程度上反映了蛋白的變性程度。從圖5可知：豆粕經100 ℃、20 min干熱處理，溶解度保持不變；隨著貯藏時間的延長，溶解度均顯著下降；經干熱處理后，溶解度下降明顯比未干熱的緩和，但貯藏到第6天時，同樣降至很低。Pro-B與DH Pro-B分別比Pro-H與DH Pro-H，溶解度下降相對較快。說明經適度干熱滅酶處理不影響蛋白的溶解度，且能減緩溶解度降低，干熱與否Pro-B均比Pro-H更易氧化變性。

注：Pro-B和Pro-H分別是DSF-B和DSF-H中的蛋白。DH Pro-B和DH Pro-H分別是經100 ℃干熱(Dry heat)處理20 min的DSF-B和DSF-H中的蛋白。

圖5 貯藏過程中溶解度變化

2.5.2 羰基含量

蛋白質氨基酸側鏈的氧化可導致羰基產物的積累，蛋白質羰基含量是蛋白質氧化損傷的敏感指標[16]。圖6顯示，在貯藏過程中，羰基含量逐漸增加，這是大豆脂肪氧合酶酶促氧化積累的結果。羰基含量：DH Pro-B低于Pro-B，DH Pro-H低于Pro-H；DH Pro-B高于DH Pro-H，Pro-B高于Pro-H。另外，在第6天時，由于Pro-B和Pro-H的溶解度過低，無法測出羰基含量。說明經適度干熱滅酶處理可以減少貯藏中蛋白的氧化損傷，干熱與否Pro-B均比Pro-H更易氧化。

圖6 貯藏過程中羰基含量變化

2.5.3 自由巰基含量

半胱氨酸殘基可能是最敏感的氨基酸殘基，將巰基轉化為其他含硫氧化物是蛋白氧化的早期現象之一[17]。如圖7所示，在貯藏前2天，Pro-B與DH Pro-B自由巰基含量逐漸減少，而Pro-H與DH Pro-H是先增加后減少。第2天之后，Pro-B與Pro-H的自由巰基含量持續下降，而DH Pro-B與DH Pro-H則基本保持不變。自由巰基含量降低，意味著蛋白質發生了變性，可能通過形成分子間二硫鍵聚集發生了氧化。自由巰基含量升高，是蛋白分子展開、內部基團暴露的結果。說明干熱滅酶處理能減弱自由巰基的氧化，干熱與否Pro-B在貯藏初期表現出比Pro-H較易氧化。

圖7 貯藏過程中自由巰基含量變化

殘余極性脂作為誘導豆粕蛋白氧化變性的主要因素，盡管DSF-B含量低于DSF-H，其油酸相對含量明顯低于豆粕-H，但貯藏過程中Pro-B更易被氧化。亞油酸和亞麻酸可以發生脂質過氧化反應，而油酸不能，DSF-B的亞油酸和亞麻酸相對含量比DSF-H略高，Pro-B更易被氧化可能與此有關。

3 結論

與正己烷制備豆粕相比，亞臨界丁烷脫脂豆粕蛋白得率較高，殘余極性脂總量低而磷脂(主要是PC)含量較高，在貯藏過程中蛋白更易被氧化，這可能與殘余極性脂組成差異有關。

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Oxidation Stability of Protein from Defatted Soybean Flour Produced by Subcritical Butane

Zhu Leping Yang Xiaoquan

(Research and Development Center of Food Proteins, College of Light Industry and Food,South China University of Technology, Guangzhou 510640)

The soybean has been defatted by subcritical butane extraction and n-hexane extraction to obtain defatted soybean flour-butane (DSF-B) and produce defatted soybean flour-hexane (DSF-H) respectively in the paper. The yield and thermal properties of proteins and residual polar lipid were analyzed and conducted comparation, as well as protein oxidation in the storage process of defatted soybean flour. The results indicated that protein yield of DSF-B was about 6% higher than that of DSF-H. Thermal properties of proteins had no difference; the denaturation temperature of both 11S proteins was lower than that for industrial white flakes. The content and composition of residual polar lipid had differences. During defatted soybean flour storage, protein from DSF-B was easier to be oxidized. The subcritical extraction technology with several optional solvent and no-high-temperature processes can be developed for vegetable protein products.

subcritical butane, n-hexane, defatted soybean flour, protein oxidation

TS214.2

A

1003-0174(2016)03-0042-05

粵港關鍵領域重點突破項目(2012A080107006)

2014-08-11

朱樂平，女，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

楊曉泉，男，1965年出生，教授，博士生導師，蛋白質化學和綜合利用