HPLC法測定彝藥火把花根中雷公藤甲素的含量

郭菊玲++楊勇幫++蔣春艷

摘要：目的建立系統、科學的火把花根中雷公藤甲素的提取和含量測定的方法，為科學評價和有效控制火把花根的質量提供了可靠的方法。 方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流動相為水-甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測波長為217 nm；柱溫為35℃。 結果火把花根中雷公藤甲素的峰得到有效的分離，HPLC檢測條件、方法的專屬性、線性、重復性、精密度、穩定性、回收率良好，該方法可以用于雷公藤甲素的含量測定。 結論該方法對今后的火把花根的質量控制和科學評價提供了參考依據。

關鍵詞：火把花根；雷公藤甲素；HPLC；含量測定

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）11-0071-04

火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是衛矛科（Celastraceae）雷公藤屬[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落葉披散或蔓狀灌木植物，又名雷公藤、斷腸草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生長于向陽山坡、路邊或灌木叢中，通常作為藥用的部位為根和皮，昆明山海棠為中國特有的植物，民間藥用中草藥。主要分布于我國的西南地區，云南省境內尤為多見，主要集中分布于昆明、楚雄、紅河、玉溪等地?；鸢鸦ǜ驼Z為“一姑妹班”、“多爭唯”意譯為“開花像火把樣通紅的植物。在西南地區彝族藥用歷史悠久。主要用于治療慢性腎炎、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等?；鸢鸦ㄒ幻驾d于《本草綱目》，李時珍集解曰：“生滇南者花紅，呼為火把花。[1]昆明山海棠有效成分研究多有報道，但是其含量測定研究少見。火把花根藥材收載于《云南省藥品標準》（1974年）、《云南省中藥材標準》第二冊·彝族藥（2005年）?，F行《中國藥典》收載的昆明山海棠片以重量法進行含量測定，且測定方法相對簡單，檢驗靈敏度、重現性還有待提高[2]。上述標準中均無火把花根藥材的含量測定項目，有必要對此項目進行研究。

火把花的化學成分較為復雜，長期研究發現火把花中含有生物堿類雷公藤堿（wilfordie）、雷公藤次堿（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其中最主要的活性成分為雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素為環氧二萜類內脂化合物，其藥理作用為：抗排斥作用、抗腫瘤作用、抗生育作用等。[4]雷公藤甲素有較強的抗腫瘤活性，并具有廣譜、高效等特點，可以用于類風濕性關節炎、強直性關節炎等多種自身免疫疾病和炎性疾病的治療。[5]目前，對于火把花根中的雷公藤甲素的含量測定方法已經有文獻報道，但是由于研究的方法不夠完善和統一，得出的結果差異性較大。因此，本次研究在現有的火把花根中雷公藤甲素的含量測定的基礎上，運用HPLC色譜法，對火把花根藥材進行了一系列的試驗，建立了一個對火把花根中雷公藤甲素進行含量測定的方法，為以后科學評價和有效控制雷公藤藥材的質量提供了可靠的科學依據。

1儀器與試藥

1.1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司真空在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器），賽多利斯BSA224S-CW電子天平，賽多利斯BP211D電子天平，DHG-9104型鼓風干燥箱，KQ-500E型超聲波清洗器，YS-04A小型高效粉碎機，Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度儀。

1.2試藥雷公藤甲素對照品（中國食品藥品檢定研究院）批號為：111567-201404，標示量為：99.8%；分析純：甲醇（四川西隴化工有限公司）、三氯甲烷（四川西隴化工有限公司）、乙醚（四川西隴化工有限公司）、乙酸乙酯（四川西隴化工有限公司）、中性氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司，200-300目），批號為：20130328色譜純為甲醇（德國默克試劑公司）；水為超純水。

2方法與結果

2.1薄層色譜鑒別取本品粉末約5 g，加80%甲醇30 mL，超聲30 min，放冷至室溫，濾過，取濾液。濾液加三氯甲烷振搖提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，并將濾液低溫蒸干。殘渣加5ml甲醇完全溶解后用含5 g中性氧化鋁的洗脫柱（內徑為1.2 cm，200目），洗脫液為甲醇：乙酸乙酯：乙醚=1：2；1 60 mL進行洗脫至無色，蒸干洗脫液，殘渣加1 mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各10 uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷—乙醚（2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%3，5—二硝基苯甲酸乙醇溶液與2mol/l氫氧化鈉乙醇液的混合液（臨用前按1：3混合）作為顯色劑，噴霧顯色，自然光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2檢測波長的確定取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為雷公藤甲素對照品溶液。取雷公藤甲素對照品溶液經紫外分光光度儀進行波長掃描，最大吸收波長為217 nm。結果如圖1，由圖1可知，雷公藤甲素的檢測波長為217 nm。圖1雷公藤的全波長掃描圖譜

2.3色譜條件與系統適應性色譜柱：Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流動相：甲醇-水（40：60）檢測波長：217 nm柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進樣：10 uL；分析時間：40 min。

2.4溶液的制備

2.4.1對照品溶液的制備對照品溶液制備：取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.4.2供試品溶液的制備供試品溶液的制備：取本品粉末（過三號篩）約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液移置分液漏斗中，加水7 mL，用氯仿振搖提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣轉移至中性氧化鋁柱用60 mL洗脫液進行洗脫（中性氧化鋁：5 g；洗脫柱內徑：1.2 cm；洗脫液體積：60 mL；洗脫液：甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1），收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5方法學考察

2.5.1專屬性考察在檢測波長：217 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 uL；流動相：甲醇-水（40：60）；的HPLC色譜條件下，將雷公藤甲素對照品溶液、樣品溶液進行HPLC分析，得到相應的色譜圖。結果如圖2所示，對照品的保留時間與樣品的保留時間一致，說明該檢測條件、方法專屬性良好。圖2雷公藤樣品圖譜

2.5.2線性關系考察取雷公藤甲素對照品，分別配制成濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的對照品溶液，進行高效液相色譜分析，以進樣濃度（mg/ml）為橫坐標，峰面積（mAU*s）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=20507X-6.3579，R2=0.9999，結果見表1。實驗結果表明在進樣濃度為0.01mg/ml～0.06mg/ml的范圍內，線性關系良好。

2.5.3重復性考察按照供試品溶液的制備方法重復處理六份供試品溶液，進樣10 uL，進行高效液相色譜法檢測，并記錄雷公藤甲素的峰面積，結果見表2，由檢測結果可知RSD%<3%，表明高效液相色譜法檢測條件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量測定。

2.5.4精密度考察精密吸取同一對照品溶液，進樣10 uL，平行進樣5次，記錄雷公藤甲素色譜峰的峰面積，計算RSD%值。結果見表3，可知RSD%<3%，表明HPLC檢測條件、方法的精密度良好，可用于雷公藤甲素的含量測定。

2.5.5穩定性考察取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、18、20、24 h進樣10 uL，并記錄雷公藤甲素的峰面積，帶入Y=20507X-6.3579，R2=0.9999計算含量，計算RSD%值為1.74%，結果顯示此方法樣品24 h內穩定性良好。

2.5.6回收率試驗分別精密稱取已知含量（0.0186 mg/g）的供試品3個重量梯度共6份，分為3組，每組兩份，配制一個濃度（0.02 mg/mL）的雷公藤甲素對照品溶液，分別向樣品溶液中加入3.4 mL、4.65 mL、5.6 mL的標準品溶液。將上述6份樣品分別樣品分別進樣10 μL進行HPLC分析，測定雷公藤甲素的峰面積，計算相應回收率及RSD%值。結果為：平均回收率為98.9%，RSD%為1.80%，表明該HPLC檢測條件、方法的可靠性強。結果見表5。

3討論

（1）火把花根的化學成分復雜，而且雷公藤甲素的本身含量極低，用普通的提取方法很難將雷公藤甲素從火把花根中提取出來，大量文獻報道的測定方法很少有給出色譜圖，有色譜圖的雷公藤甲素的峰面積較小且分離度不夠，本次研究通過大量的試驗，發現用氯仿萃取后通過中性氧化鋁柱層析，加洗脫液進行洗脫后，雷公藤中雷公藤甲素的得到了很好的分離。調整洗脫液的用量，雷公藤甲素洗脫完全，雷公藤甲素的含量也明顯增加。此次研究反復多次對樣品前處理方法進行來探索，為使用HPLC法測定火把花根中雷公藤甲素的含量打下了堅實的基礎。該含量測定方法對今后的火把花根的質量控制和科學評價提供了參考依據。

（2）含量測定方法確立的過程中，樣品前處理至關重要。前期薄層色譜篩查的時候，因為樣品中雷公藤甲素含量很低，但其又是藥理活性成分。所以選其為質控目標物。縱觀整個樣品處理過程對藥品企業藥品生產工藝有實際指導意義。民族民間使用火把花根大多以酊劑，以用乙醇溶液浸泡的形式出現，藥效顯著；使用湯劑的很少。本次研究中，也用過水以及不同的甲醇溶液進行提取。最終發現用甲醇提取時，雷公藤甲素的提取效率最大。這就提醒我們從事傳統民族民間藥物的現代工藝開發研究一定要尊重傳統民間醫藥的用藥習慣，才能有的放矢。才能真正推動民族藥的發展。

參考文獻：

[1]張航行，耿會玲，楊維霞.昆明山海棠的化學成分及藥理活性研究進展[J].中草藥，2012，23（6）：42-44.

[2]衛生部.中國藥典[S].北京，化工出版社，2015.1056.

[3]王賢英、謝香菊、李勝容.中藥材火把花中雷公藤甲素及表兒茶素的含量測定[J].重慶中草藥研究，2012，1（65）：17-21.

[4]劉勸，王友群.雷公藤甲素的藥理作用研究[J].中國藥科大學藥理研究室，2005，29（4）：156-161.

[5]陳江飛，胡毅堅，苗彩云.雷公藤甲素藥理作用研究進展[J].中國醫藥工業雜志，2007，38（8）：604-606.