基因表達載體相關問題解讀

吳浩

基因工程操作的核心是構建基因表達載體，圍繞表達載體的考題有逐年增多的趨勢。下面從不同的角度對表達載體進行解讀。

一、基因表達載體的一般結構及各部分的功能

如上圖，基因表達載體一般由目的基因（插入基因）、啟動子、終止子、標記基因（抗生素抗性基因）等結構組成。

啟動子是復制原點附近的一段有特殊結構的DNA，位于基因的首端。啟動子和特定的物質（如激素）作用后，通過一系列復雜的正反饋機制，激活復制原點（復制原點通常與某些酶結合）。

終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結構的DNA。終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄或復制在所需要的地方停止下來。

復制原點處的A和T特別多，氫鍵相對較少，不穩定，DNA容易解旋，因此易與引物結合，成為轉錄的起點或復制的起點。

抗生素抗性基因作為標記基因，其作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。標記基因又稱報告基因，抗生素抗性基因是其中的一種。

二、基因表達載體中啟動子、終止子的來源及特點

（1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子，因為目的基因中已含有啟動子、終止子。（2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。若只將基因的編碼序列導入受體細胞，目的基因沒有啟動子、終止子，是無法轉錄或復制的，因此，在構建基因表達載體時，在與質粒結合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。（3）特異性啟動子。組織特異性啟動子又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特性。如用乳房生物反應器生產藥用蛋白，使用的便是該類基因。

三、標記基因是否為質粒結構

作為運載體必須具備以下幾個特點：能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。質粒是基因工程最常用的運載體，它存在于許多細菌等生物體中，是能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。根據此分析可知，標記基因是質粒上固有的。但在實踐中，由于構建載體的目的不同，需要的標記基因也會不同，有的標記基因是需要另外加上的，如將綠色熒光蛋白基因與目的基因做成融合基因，根據熒光蛋白的特性來確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位。

四、載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如上圖所示。