超高壓高效液相色譜法測定茶酒中茶氨酸含量

楊 威， 呂超志， 劉 峰， 李 丹， 曹 忠

(長沙理工大學化學與生物工程學院，微納生物傳感與食品安全檢測協同創新中心，湖南長沙 410114)

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超高壓高效液相色譜法測定茶酒中茶氨酸含量

楊 威， 呂超志， 劉 峰， 李 丹， 曹 忠*

(長沙理工大學化學與生物工程學院，微納生物傳感與食品安全檢測協同創新中心，湖南長沙 410114)

[目的] 研究茶酒中茶氨酸含量的分析方法。[方法] 以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生劑，采用超高壓高效液相色譜測定茶酒中的茶氨酸。[結果]檢測茶氨酸的線性范圍為0.1～100.0 μg/mL，線性方程可擬合為Y=53.57X-41.664，相關系數r為0.999 59，該方法的最低檢出限達到0.05 μg/g(以S/N=3計)。樣品中茶氨酸的含量為0.25 mg/kg，加標試驗的回收率在99.6%～100.1%。[結論] 該方法快速、簡單、定量準確，可在茶氨酸的測定分析中推廣應用。

超高壓；高效液相色譜；茶酒；茶氨酸

茶酒是茶葉經過復雜的釀制工藝釀造而成的一種既有酒的香醇又有茶的香氣的保健型功能飲料酒，具有醒腦明目、殺菌解毒和健胃生津的功效。目前國內外的主要研究方向為保健茶酒的生產方式、茶酒成分及功效分析[1-2]。

茶氨酸是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，在茶葉氨基酸中占50%左右。茶氨酸不僅能降壓、抗腫瘤，還能促進神經生長[3]，同時茶氨酸還能夠提高食品鮮味，具有放松大腦的功能。對老鼠的腦電圖研究表明,茶氨酸表現出了咖啡因抑制特性[4]。茶的主要成分如茶氨酸等是主要的生物活性物質，有益于人們的健康，以茶成分為基礎的產品如冷熱茶飲料、茶保健品及化妝品等也受到人們的關注[5]。因此，研究簡單靈敏，能快速定性、定量分析不同茶葉中茶氨酸含量的方法已引起廣泛重視。目前對茶氨酸的分析方法主要有傅立葉變換近紅外(FT-IR)光譜法[6]、電動力學毛細管色譜法(ECC)[7-8]、酶催化法[9]、紙層析-分光光度法[10]、離子對色譜法[11]、薄層色譜法[12]、氣相色譜法[13]、氣質聯用法[13]、柱后補償高效液相色譜法[14]、手性衍生-高效液相色譜法[15]等。為了提高分析檢測的靈敏度和分離的選擇性，筆者結合樣品特性，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生超高壓液相色譜法分析茶酒中的茶氨酸，以期能夠達到快速、準確的分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料供試茶酒，市售。Agilent 1290 超高壓液相色譜儀，美國安捷倫公司；數顯恒溫水浴鍋，常州市頂新實驗儀器有限公司；分析天平，北京科儀儀器有限公司。

茶氨酸標準品(純度>99%)，壇墨質檢標準物質中心；鄰苯二甲醛(OPA)、硼酸鹽溶液，美國安捷倫公司；甲醇、乙腈，色譜純，默克化工技術(上海)有限公司；磷酸氫二鈉，重慶市華東化工有限公司。所用試劑除注明外均為分析純或優級純，試驗用水均為超純水(電阻率≥18.3MΩ·cm)。

1.2 樣品的處理

1.2.1標準溶液的配制。準確稱取一定質量的茶氨酸標準品于10 mL容量瓶中，用超純水溶解配制成濃度為1.00 mg/mL的標準儲備液，該溶液可在4 ℃的條件下存放3個月。試驗測定時移取不同體積的上述儲備液于容量瓶中，用超純水稀釋定容配制成相應梯度的標準溶液。

1.2.2樣品的前處理。準確稱取5.0 g(精確到0.001 g)茶酒樣品于比色管，加水稀釋至5 mL。于70 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，冷卻至室溫，過0.45 μm的水系濾膜，待進樣分析。

1.3 色譜條件色譜柱：Eclipse AAA C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)；流動相A：40 mmol/mL Na2HPO4溶液(用NaOH 溶液調pH至7.8)；流動相B：ACN∶MeOH∶H2O(45∶45∶10，V/V/V)；流速0.5 mL/ min；柱溫35 ℃；檢測波長338 nm。流動相隨時間的變化進行梯度洗脫，具體洗脫條件見表1。

1.4 柱前衍生Agilent 1290的自動進樣器可以進行程序進樣，柱前衍生的過程可以在自動進樣器中進行，具體程序如表2所示。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇由于茶氨酸的極性較強[13-15]，依據反相色譜分離原理，化合物的保留時間取決于固定相碳的數目。通過對不同C18柱在超高壓下的試驗，發現普通的C18柱在超高壓下容易出現疏水塌陷，雜質干擾大，響應值較弱，而Eclipse AAA C18柱能較好地分離雜質，保留能力也較強。因此選擇Eclipse AAA C18柱進行試驗。

表1 流動相洗脫梯度

表2 衍生程序

2.2 檢測波長的選擇取某濃度的標準溶液進行衍生后進樣，在190～610 nm波長范圍內進行茶氨酸衍生物的紫外吸收掃描。從測得的光譜圖可以發現，其衍生物的最大吸收波長在335～345 nm，通過多波長的設定及對標準溶液和樣品的測定，結合雜質的干擾和衍生物響應值的考量，最終選擇338 nm作為最佳的檢測波長。標準溶液色譜圖見圖1所示。

圖1 L-茶氨酸標準溶液色譜

2.3 線性關系及檢出限配制不同濃度的茶氨酸標準溶液，再在最佳的色譜條件進行測定，以標準溶液濃度X(μg/mL)為橫坐標，以色譜峰的峰面積Y為縱坐標進行線性回歸分析，結果顯示：線性方程Y=53.57X-41.664，相關系數r為0.999 59，線性范圍為0.1～100.0 μg/mL，濃度和峰面積呈現出良好的線性關系，方法的最低檢出限為0.05 μg/g(以S/N=3計)。相關數據如圖2所示。

圖2 線性圖譜

2.4 精密度及方法穩定性取一定濃度的茶氨酸標準溶液在同一天內進行6次測定，測得的峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.9%。取衍生前樣品和衍生樣品各2份，分別放置0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 h后進行測定，通過對測定峰面積數據的處理得出其相對標準偏差為1.1%。上述2個試驗說明方法的精密度較佳，衍生前和衍生后樣品在一定時間內性質較穩定。

2.5 樣品測定結果及回收率采用標準加入法進行回收率試驗，分別在空白溶液和待測樣品中加入不同濃度的標準溶液，按照樣品處理方法進行處理后上機測定，對測定數據進行整理后如表3所示。從表3可以看出，樣品的茶氨酸含量為0.25 mg/kg，加標試驗的回收率在99.6%～100.1%，滿足普通實驗室對茶氨酸分析的要求。

表3 加標回收試驗

3 結論

該試驗采用超高壓高效液相色譜對茶酒中茶氨酸的含量進行了分析研究，利用OPA衍生劑增加了茶氨酸的紫外吸收效果，超高壓高效液相色譜對目標物的保留時間、響應靈敏度都有較大地提升。該方法快速、簡單、定量準確，易于在茶氨酸的測定分析中推廣應用。

[1] 衛春會，羅惠波，豆永強.我國茶酒生產現狀及發展[J].釀酒科技，2007(10)：126-127,129.

[2] 周才碧，張敏星，穆瑞祿，等.淺析茶酒的研制與發展[J].釀酒，2014，41(1)：71-74.

[3] 朱松，王洪新.OPA柱前衍生高效液相色譜法測定茶氨酸的研究[J].食品工業科技，2005，26 (2):182-183.

[4] RANA A，SINGH H P，GULATI A.Concurrent analysis of theanine,caffeine,and catechins using hydrophobic selective C12stationary phase[J].J Liquid Chromatogr Relat Technol,2015,38(6):709-715.

[5] HARA Y.Green tea:Health benefits and applications[M].New York：Food Science and Technology,Marcel Dekker,Inc.,2001.

[6] SONG H J，KIM Y D，JEONG M J，et al.Rapid selection of theanine-rich green tea (CamelliasinensisL.) trees and metabolites profiling by fourier transform near-infrared (FT-IR) spectroscopy[J].Plant Biotechnol Rep,2015,9(2):55-65.

[7] HANCU G,SIMON B,RUSU A,et al.Principles of micellar electrokinetic capillary chromatography applied in pharmaceutical analysis[J].Adv Pharm Bull,2013,3(1):1-8.

[8] 張峻萍，方從兵，宛曉春，等.茶葉中茶氨酸的膠束電動毛細管電泳定量方法初步研究[J].茶葉通報，2006，28(3):108-110.

[9] SHIMIZU Y，IMAOKA M，YANO S，et al.Sensitive enzymatic method for the quantification of theanine,a principal umami component of commercial tea beverages[J].Food Sci Technol Res,2013,19(5):909-913.

[10] 馬雪瀧，鄒鵬飛，王蕩強，等.紙層析-分光光度法檢測茶氨酸[J].植物生理學報，2012，48(4):413-417.

[11] 龔雨順，黃建安，崔湘興，等.離子對色譜法測定茶葉中的茶氨酸[J].茶葉科學，2008，28(2):89-92.

[12] 劉小力，李想.茶葉中茶氨酸含量的測定方法研究[J].食品科學，2009，30(14):281-284.

[13] 張佳，王川丕，阮建云.GC-MS及GC測定茶葉中主要游離氨基酸的方法研究[J].茶葉科學，2010，30(16):445-452.

[14] 趙粼，闕斐，周曉紅，等.柱后補償液相色譜與電霧式檢測器結合測定茶氨酸含量[J].食品工業科技，2013，34(1):317-318.

[15] 李銀花，劉仲華，黃建安.手性衍生-高效液相色譜法拆分和定量測定茶氨酸對映體[J].色譜，2007，25(5):719-722.

Determination of Theanine in Tea Liquor by Ultra High Pressure and High Performance Liquid Chromatography

YANG Wei,LU Chao-zhi,LIU Feng,CAO Zhong*et al (Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection,School of Chemistry and Biological Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha,Hunan 410114)

[Objective] The analytical method for content of theanine in tea liquor was investigated.[Method] Using o-phthalaldehyde (OPA) as a derivating agent,a method was established for determination of theanine in tea liquor by super high-pressure high performance liquid chromatography.[Result] The results showed that the linear range of 0.1-100.0 μg/mL for theanine detection was obtained,and the corresponding linear equation was fitted asY=53.57X-41.664 with correlation coefficientrof 0.999 59.Also,the minimum detection limit of 0.05 μg/g (S/N=3) was reached.The theanine content of the sample was determined as 0.25 mg/kg with a recovery rate of 99.6%-100.1%.[Conclusion] The method is rapid,simple and accurate,which is easy to be widely used in the determination and analysis of theanine in tea liquor.

Ultra high pressure; High performance liquid chromatography; Tea liquor; Theanine

國家自然科學基金項目(31527803)。

楊威(1983- )，男，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：食品/藥品質量檢測。*通訊作者，教授，博士，從事化學生物傳感與食品、藥品安全檢測研究。

2016-08-12

TS 262.91

A

0517-6611(2016)30-0070-02