1株益生蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

黃秀敏， 李學(xué)優(yōu)， 葉俊豪， 夏楓耿， 曹 丁 (廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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1株益生蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

黃秀敏， 李學(xué)優(yōu)， 葉俊豪， 夏楓耿， 曹 丁 (廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

[目的]通過優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，提高蠟樣芽孢桿菌的生物量。[方法]在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗和正交試驗確定蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳氮源和碳氮比。[結(jié)果]優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米漿干粉30.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L。優(yōu)化后蠟樣芽孢桿菌在50 L不銹鋼發(fā)酵罐中的發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，較優(yōu)化前提高了1個數(shù)量級。[結(jié)論]優(yōu)化后的蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基大大提高了該菌的生物量，為工業(yè)化放大生產(chǎn)提供了參考。

蠟樣芽孢桿菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

芽孢桿菌是一類兼性厭氧或好氧，革蘭氏陽性桿菌的總稱,產(chǎn)芽孢，生理特征豐富多樣,分布極其廣泛，是植物體表、根際以及土壤、空氣的重要微生物種群。芽孢桿菌是一類產(chǎn)生大量不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽抗菌物質(zhì)的物種[1]。

蠟樣芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，主要分布于塵埃、土壤、植物、水及空氣中，能產(chǎn)生具有抗逆性內(nèi)生芽孢，對紫外線、離子輻射、熱和抗菌素及其他化學(xué)藥品的抗性較高[2]。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生多種有益生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥保健、農(nóng)業(yè)、食品和飼料等各領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用，牧漁養(yǎng)殖業(yè)上用作飼料添加劑，農(nóng)業(yè)上用作生防制劑[3-4]。筆者通過單因素試驗和正交試驗對1株益生蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，并進行了50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試試驗，以期為蠟樣芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。蠟樣芽孢桿菌由廣州市微生物研究所提供。

1.1.2培養(yǎng)基。種子和檢測培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，氯化鈉5.00 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加20.00 g/L瓊脂粉。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.00 g/L，酵母粉20.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L，磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L，pH 7.0。

1.1.3主要試劑。胰蛋白胨(英國Oxoid 公司)、瓊脂粉(廣東省廣州環(huán)凱生物科技有限公司)、酵母粉(湖北安琪酵母股份有限公司)、蛋白胨(貴州新華生化科技發(fā)展有限公司)、玉米漿干粉(山東康源生物科技有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4主要儀器。生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、752N 型紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、pHS-25 數(shù)顯酸度計(上海雷磁儀器廠)、50 L不銹鋼發(fā)酵罐(上海洋格生物工程設(shè)備有限公司)、DHZ-DA大容量全溫振蕩器(江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠)。

1.2 方法

1.2.1蠟樣芽孢桿菌生長曲線的繪制。將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每間隔3 h取樣測定發(fā)酵液的pH和OD值，繪制菌體生長曲線。

1.2.2蠟樣芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵試驗。從新鮮種子斜面挑取1環(huán)菌體，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，制成種子液；以1%的接種量將活化好的種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測定OD值。

1.2.3發(fā)酵過程參數(shù)測量。

1.2.3.1菌體生物量測定。測量經(jīng)適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液在600 nm波長處的OD值。

1.2.3.2pH測定。用pHS-25數(shù)顯酸度計測定。

1.2.3.3菌落計數(shù)。采用平板菌落計數(shù)法。

1.2.4最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定。

1.2.4.1最佳碳源的確定。分別用30.00 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，其余配方同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵試驗。

1.2.4.2最佳氮源的確定。在篩選出最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別用23.00 g/L的酵母粉、玉米漿干粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕粉、硫酸銨替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，其余配方同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵試驗。

1.2.4.3正交試驗。采用4因素3水平L9(34)正交表進行優(yōu)化試驗，研究影響蠟樣芽孢桿菌生長的主要因素：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨和玉米漿干粉，求取最佳配比。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.5發(fā)酵中試試驗。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果，在50 L不銹鋼發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)驗證，發(fā)酵罐裝液量為25 L。種子培養(yǎng)同搖瓶試驗，接種量為4%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，通風(fēng)量為10 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，罐壓保持在0.04～0.06 MPa，發(fā)酵過程中pH保持在7.0左右。每2 h取樣，測定發(fā)酵液的OD值，同時觀察芽孢形成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌生長曲線由圖1可知，蠟樣芽孢桿菌在0～3 h處于遲緩期，3 h以后進入對數(shù)生長期，OD值快速提高，至12 hOD值達(dá)到最高,進入穩(wěn)定期，從18 h開始，蠟樣芽孢桿菌進入衰亡期。在生產(chǎn)中通常使用對數(shù)期的菌體作為種子，此時菌體生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、活細(xì)菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)大致接近、細(xì)胞的化學(xué)組成形態(tài)理化性質(zhì)基本一致，所以選定蠟樣芽孢桿菌的最佳種齡是12 h。

此外，隨著培養(yǎng)時間的增加，pH逐漸上升，說明蠟樣芽孢桿菌在增值過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為堿性物質(zhì)。

圖1 蠟樣芽孢桿菌的生長曲線和pH變化曲線

2.2 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1最佳碳源。由圖2可知，可溶性淀粉作為碳源時蠟樣芽孢桿菌的生長明顯優(yōu)于其他碳源，OD值達(dá)14，所以最佳碳源為可溶性淀粉，其次是葡萄糖，最差的是玉米淀粉。但是考慮到可溶性淀粉是多糖，而葡萄糖作為速效碳源，能迅速啟動菌體生長，縮短發(fā)酵周期，故選擇葡萄糖和水溶性淀粉搭配使用作為復(fù)合碳源。

圖2 碳源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響

2.2.2最佳氮源。由圖3可知，選用玉米漿干粉作為氮源時的OD值極顯著高于其他組別，蛋白胨和牛肉膏次之。玉米漿干粉是以鮮玉米漿為原料經(jīng)低溫瞬間加熱噴霧干燥而成，其水溶性蛋白質(zhì)保存完好，在微生物發(fā)酵過程中提供水溶性植物蛋白及水溶性維生素等營養(yǎng)元素。使用硫酸銨時，生物量顯著低于其他組別，說明蠟樣芽孢桿菌在有機氮源中的生長明顯優(yōu)于無機氮源。由于硫酸銨能促進芽孢的生成，所以保留硫酸銨作為無機氮源。同樣考慮到速效氮源有利于菌體快速啟動，縮短遲緩期，同時蛋白胨的成本遠(yuǎn)低于牛肉膏，故選擇蛋白胨和玉米漿干粉搭配使用作為最佳氮源。

圖3 氮源對蠟樣芽孢桿菌生長的影響

2.2.3正交試驗結(jié)果。根據(jù)表2極差大小得出各因素對蠟樣芽孢桿菌生物量影響的顯著性順序為玉米漿干粉>可溶性淀粉>蛋白胨>葡萄糖。最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A2B3C1D2，即1.5%葡萄糖、4.0%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、3.0%玉米漿干粉。在搖瓶中對優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進行驗證，測得OD值為52.335，與正交試驗結(jié)果一致。

2.3 50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試試驗結(jié)果由圖4可知，0～2 h為遲緩期，較搖瓶縮短了1 h，鏡檢菌體稀少；2～12 h為對數(shù)生長期，菌體快速增值，12 hOD值達(dá)到最高,為61.505，高于搖瓶正交試驗結(jié)果，生物量最大，此時鏡檢菌體增大、增

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

長，并開始形成芽孢，這是因為發(fā)酵罐攪拌和溶氧量遠(yuǎn)高于搖瓶，更有利于菌體生長；12 h后進入穩(wěn)定期，鏡檢菌體基本全部形成芽孢；20 h進入衰亡期，菌體明顯變少，芽孢開始脫落。12 h發(fā)酵液活菌計數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，芽孢率為96%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定了蠟樣芽孢桿菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖15.00 g/L，可溶性淀粉40.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，玉米漿干粉30.00 g/L，硫酸銨3.00 g/L,磷酸氫二鉀5.00 g/L，磷酸二氫鈉5.00 g/L，硫酸鎂1.25 g/L，硫酸錳0.60 g/L，氯化鈣2.00 g/L。優(yōu)化后搖瓶OD值達(dá)52.335，是優(yōu)化前的4倍，50 L不銹鋼發(fā)酵罐中試發(fā)酵的OD值為61.505，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)1.6×1010cfu/mL，較優(yōu)化前的發(fā)酵液活菌數(shù)提高了1個數(shù)量級,表明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基顯著提高了蠟樣芽孢桿菌的生物量，具有實際應(yīng)用價值，可為今后規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

圖4 蠟樣芽孢桿菌在50 L發(fā)酵罐中的生長曲線

[1] STEIN T.Bacillussubtilisantibiotics:Structures,synthesis and specific functions[J].Mol Microbiol,2005,56(4):845-857.

[2] 秦玉昌,潘寶海,于榮，等.芽孢桿菌對畜禽生產(chǎn)性能的影響[J].中國飼料,2004(16):8-10.

[3] 聶實踐，林伯荃，朱桂茹，等.益生多(S-586)飼用微生態(tài)制劑的防病作用實驗[J].飼料研究,1999(5):27-28.

[4] 張惠云.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].飼料博覽,2000，21(6):46-47.

Optimization of Fermentation Medium for A ProbioticBacilluscereus

HUANG Xiu-min,LI Xue-you, YE Jun-hao et al (Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou,Guangdong 510663)

[Objective] To increase the biomass ofBacilluscereusby optimizing the its fermentation medium.[Method] On the basis of initial fermentation medium,the single factor experiment and orthogonal experiment were used to determine the optimum carbon and nitrogen ratios in fermentation medium.[Result] The optimized fermentation medium was:15.00 g/L glucose,40.00 g/L soluble starch,10.00 g/L peptone,corn steep powder 30.00 g/L,3.00 g/L ammonium sulfate,5.00 g/L dipotassium hydrogenphosphate,5.00 g/L dihydrogen phosphate sodium,1.25 g/L magnesium sulfate,0.60 g/L manganese sulfate,and 2.00 g/L calcium chloride.After optimization,fermented viable cell count ofBacilluscereusin 50 L cans reached up to 1.6 ×1010cfu/mL,which improved an order of magnitude comparing with that before optimization.[Conclusion] The optimized culture medium greatly enhances the biomass ofBacilluscereus,which provides references for the large-scale production in industrialization.

Bacilluscereus; Fermentation culture medium; Optimization

廣東省廣州市科技計劃項目(201605040004)；廣東省省級科技計劃項目(2016B090918055)。

黃秀敏(1990- )，女，廣東梅州人，助理工程師，從事微生物研究。

2016-09-14

S 182

A

0517-6611(2016)30-0007-02