電化學(xué)生物傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的研究進(jìn)展

馬海華 張 元 甄 彤 孫楫舟 夏善紅

(傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所1，北京 100190)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生院2，北京 100080)(河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院3，鄭州 450001)(糧食信息處理與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4，鄭州 450001)

電化學(xué)生物傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的研究進(jìn)展

馬海華1，2，3，4張 元1，4甄 彤3孫楫舟1夏善紅1

(傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所1，北京 100190)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生院2，北京 100080)(河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院3，鄭州 450001)(糧食信息處理與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4，鄭州 450001)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有劇毒性和嚴(yán)重的致癌性、致畸性和致突變性，攝入受黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物和食品會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物的身體健康造成極其嚴(yán)重的危害。基于十年來國(guó)內(nèi)外的研究成果，從電化學(xué)傳感機(jī)理方面概述了電化學(xué)生物傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的發(fā)展現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，介紹了各類電化學(xué)生物傳感器的工作原理、制備方法和檢測(cè)性能。電化學(xué)生物傳感器相比于傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、成本低、便于微型化等優(yōu)勢(shì)。金納米顆粒、碳納米管等納米材料的使用將進(jìn)一步提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度以及抗原或抗體的固定效率。超微電極技術(shù)、傳感器陣列技術(shù)以及微流控技術(shù)的應(yīng)用也將進(jìn)一步提高電化學(xué)生物傳感器在毒素檢測(cè)中的性能。

黃曲霉毒素 電化學(xué) 生物傳感器 免疫分析 納米材料

霉菌毒素是真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在自然界中廣泛存在，攝取、吸入或通過皮膚吸附霉菌毒素，可以使人或動(dòng)物的機(jī)能下降、致病、甚至死亡。在400多種不同的霉菌毒素中，黃曲霉毒素(aflatoxin)，尤其是黃曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最強(qiáng)的一種霉菌毒素。黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已經(jīng)能夠分離并識(shí)別的有18種。它們由C、H、O 3種元素組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)非常類似，分子中均含有1個(gè)雙呋喃環(huán)和1個(gè)香豆素。在各種黃曲霉毒素中，最主要的4種是黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，即AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。當(dāng)牛攝入含AFB1的飼料后，會(huì)在體內(nèi)通過肝微粒體酶作用而被羥基化，轉(zhuǎn)變成黃曲霉毒素M1(AFM1)，存在于牛的乳汁中。

黃曲霉毒素具有劇毒性和嚴(yán)重的致癌性、致畸性、致突變性，且能夠抑制機(jī)體的免疫力，特別是引起肝臟的慢性或急性損害。1993年，國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2歸為1類致癌物，AFM1歸為2B類致癌物。2002年，IARC專論中指出，AFB1暴露是引發(fā)人類原發(fā)性肝癌的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素[1]，痕量AFB1即可造成人類或動(dòng)物的急性中毒死亡或慢性累積致癌等極其嚴(yán)重的危害。

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，能夠在產(chǎn)前、產(chǎn)后、加工、儲(chǔ)存等多個(gè)環(huán)節(jié)污染多種農(nóng)作物和食品，如花生、谷物、玉米、大米、堅(jiān)果、飼料、牛奶等。人們通過攝入被黃曲霉毒素污染的糧食造成直接暴露，或通過食用動(dòng)物產(chǎn)品造成間接暴露。長(zhǎng)期攝入被黃曲霉毒素污染的食品，即使黃曲霉毒素濃度很低，由于其在體內(nèi)累積，也會(huì)威脅到人們的健康，造成肝臟損傷，甚至死亡。

由于黃曲霉毒素的熱穩(wěn)定性非常好，一旦形成很難遭到破壞，另外，就現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)和食品生產(chǎn)流程條件來看，無法徹底避免食品及飼料中的黃曲霉毒素，所以發(fā)展和建立健全對(duì)黃曲霉毒素的監(jiān)控和檢測(cè)就顯得尤為重要。為此，大多數(shù)國(guó)家都制定了食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，歐盟制定的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格[2]，規(guī)定在直接人類消費(fèi)品谷物、花生和干果中AFB1的最高限量為2 μg/kg，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2總和最高限量為4 μg/kg，牛奶中AFM1的最高限量為0.05 μg/kg。我國(guó)衛(wèi)生部也頒布了食品中黃曲霉毒素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中規(guī)定了AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)，沒有針對(duì)總量的限制要求。

目前，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采納的檢測(cè)黃曲霉毒素的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫親和層析凈化熒光光度法等。雖然這些方法被廣泛采用，但是通常需要在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下開展，所需的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，要求有專業(yè)技術(shù)人員操作，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，近年來研究和開發(fā)低成本、快速、簡(jiǎn)單、靈敏、特異性好的生物傳感器得到了越來越廣泛的關(guān)注。

生物傳感器主要包含2個(gè)重要單元：生物識(shí)別單元(如抗體、酶等)和換能器(如電極、光波導(dǎo)和懸臂梁等)[4]，如圖1所示。生物識(shí)別單元與目標(biāo)分子之間一般具有特異性結(jié)合的親和性，使生物傳感器通常具有很高的選擇性。換能器與生物識(shí)別單元緊密接觸，同時(shí)又與數(shù)據(jù)接收和處理系統(tǒng)相連，它將生物識(shí)別單元產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)或光信號(hào)等可測(cè)量的信號(hào)。

圖1 生物傳感器的組成

基于免疫分析的生物傳感器使用抗原或抗體作為生物識(shí)別單元。由于黃曲霉毒素是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，所以，為了便于固定以及與抗體結(jié)合，通常需要將其與牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)形成結(jié)合物(如BSA-AFB1)。為進(jìn)一步放大響應(yīng)信號(hào)，有時(shí)需要對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，例如用酶標(biāo)記抗原或抗體，能夠起到對(duì)電流信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大作用[5]，因?yàn)槊甘且环N具有強(qiáng)力催化作用的蛋白質(zhì)，能夠催化底物發(fā)生酶促氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流。在黃曲霉毒素電化學(xué)免疫生物傳感器中常用作標(biāo)記物的酶有：堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)[6-10]和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)[11-18]。除了基于抗原-抗體的免疫分析之外，黃曲霉毒素生物傳感器也可以將乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)作為生物識(shí)別單元[19-22]，利用黃曲霉毒素對(duì)AChE的抑制作用來制備。

換能器在生物傳感器檢測(cè)過程中發(fā)揮著重要作用，根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換方式的不同，換能器可以是電化學(xué)、光學(xué)、壓電、微機(jī)械、熱感應(yīng)或磁性元件中的一種或幾種的結(jié)合。其中，基于電化學(xué)原理的生物傳感器占有非常重要的地位，是應(yīng)用最廣泛、種類最多和商用最成功的一類生物傳感器[23]，具有選擇性好、成本低、操作簡(jiǎn)單、易于微型化等特點(diǎn)。電化學(xué)生物傳感器可以基于抗原和特定抗體間的高親和性反應(yīng)，也可以基于酶的催化氧化或酶活性的抑制等生物反應(yīng)機(jī)理。該類傳感器將生物反應(yīng)轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的電信號(hào)，常用的換能器一般是三電極系統(tǒng)，包含工作電極、對(duì)電極和參比電極。工作電極上通常修飾導(dǎo)電和生物敏感材料，用于識(shí)別目標(biāo)分析物，常用的有金等貴金屬電極、絲網(wǎng)印刷電極和玻碳電極等。根據(jù)電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不同，可以將電化學(xué)生物傳感器分為電流型、阻抗型、電導(dǎo)型和電勢(shì)型。

基于十年來國(guó)內(nèi)外的研究成果，從電化學(xué)生物傳感機(jī)理、電化學(xué)測(cè)量技術(shù)以及免疫的角度綜述了電化學(xué)生物傳感器在黃曲霉毒素檢測(cè)中的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道的各種黃曲霉毒素電化學(xué)生物傳感器的機(jī)理和性能概述見表1。

1 電流型電化學(xué)生物傳感器

電流型電化學(xué)生物傳感器也被稱為安培型電化學(xué)生物傳感器，主要探測(cè)生物電化學(xué)反應(yīng)中的電活性物質(zhì)，在一定的電極電壓下，通過電極表面或其修飾層內(nèi)氧化還原反應(yīng)生成的電流隨時(shí)間的變化來測(cè)量分析物[39]。

基于免疫分析的黃曲霉毒素電流型生物傳感器通常將抗原與BSA的結(jié)合物或抗體固定在修飾電極表面，通過競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)使抗原-抗體結(jié)合，有時(shí)需要使用酶標(biāo)記抗原、抗體或二抗，響應(yīng)電流與酶的活性相關(guān)，從而與待測(cè)液中黃曲霉毒素的濃度相關(guān)。

在利用酶促反應(yīng)的免疫傳感器中，常用ALP標(biāo)記二抗[9-13]。Ammida等[6，10]將BSA-AFB1固定在一次性單個(gè)絲網(wǎng)印刷電極表面，待測(cè)液中的游離AFB1與固定在電極表面的BSA-AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合anti-AFB1抗體，利用ALP標(biāo)記二抗作為信號(hào)放大系統(tǒng)，使用差分脈沖伏安法檢測(cè)ALP催化底液中1-萘基磷酸鹽產(chǎn)生的響應(yīng)電流，電流隨AFB1濃度增大而減小。結(jié)果顯示在實(shí)際大麥樣品中的背景信號(hào)要大于在AFB1標(biāo)準(zhǔn)液中的信號(hào)，所以基質(zhì)效應(yīng)是實(shí)際樣品檢測(cè)中一個(gè)需要考慮的問題。Piermarini等[8-9]采用類似的方法，使用8個(gè)絲網(wǎng)印刷電極或含有96個(gè)絲網(wǎng)印刷電極的96孔微板形成傳感器陣列，分析了該傳感器在實(shí)際玉米樣品中的檢測(cè)性能。相對(duì)于基于單個(gè)絲網(wǎng)

表1 黃曲霉毒素電化學(xué)生物傳感器

注：MAb為Monoclonal antibody；PAb為Polyclonal antibody；檢測(cè)時(shí)間指從電極接觸待測(cè)液到最后一種試劑滴加并反應(yīng)完畢所需的時(shí)間，不包括電極的修飾時(shí)間和讀取信號(hào)時(shí)間。

印刷電極的傳感器來說，傳感器陣列的優(yōu)勢(shì)在于能夠同時(shí)開展多個(gè)試驗(yàn)，節(jié)省時(shí)間。另外，Tan等[7]利用了酶催化銀沉積的信號(hào)放大方法，BSA-AFB1固定在巰基乙胺修飾的金電極表面，二抗標(biāo)記物ALP催化底液中的抗壞血酸2-磷酸酯生成抗壞血酸，銀離子被還原成金屬銀沉積在電極表面。

HRP也常用來標(biāo)記抗原[11-13]和抗體[14-15]或作為封閉液封閉電極表面的活性位點(diǎn)[17]。Neagu等[11]、Paniel等[12]和Parker等[13]采用直接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法制備AFM1電流型生物傳感器，將anti-AFM1抗體固定在電極表面，游離的AFM1和HRP標(biāo)記AFM1(AFM1-HRP)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合anti-AFM1抗體，HRP催化底液的氧化還原反應(yīng)，檢測(cè)響應(yīng)電流。其中，Neagu等[11]用抗小鼠免疫球蛋白G抗體預(yù)活化電極表面，以增大anti-AFM1抗體的固定量并獲得更好的定向性。Parker等[13]采用光刻技術(shù)制備含有35個(gè)正方形微電極的金微電極陣列，片上集成輔助電極和參比電極，結(jié)果顯示牛奶對(duì)電極表面的干擾非常小。Paniel等[12]將anti-AFM1抗體包被在磁性納米顆粒表面，通過外加磁場(chǎng)將anti-AFM1抗體固定在絲網(wǎng)印刷電極表面，用計(jì)時(shí)電流法和循環(huán)伏安法檢測(cè)HRP在底液中產(chǎn)生的酶促氧化還原電流。Sun等[14]在玻碳電極表面制備了一種新型生物復(fù)合膜，包含HRP標(biāo)記anti-AFB1抗體、金納米顆粒、二氧化鈦溶膠、室溫離子液和全氟磺酸。抗原-抗體結(jié)合物阻礙了HRP活性中心到電極表面的直接電子傳遞，使得HRP對(duì)H2O2催化反應(yīng)產(chǎn)生的峰電流減小。Tang等[15]制備出一種基于磁珠和銦錫氧化物(indium tin oxide，ITO)電極的傳感器，HRP標(biāo)記的anti-AFB1抗體與金納米顆粒結(jié)合，多功能磁珠作為親和性載體用來固定BSA-AFB1，競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)后形成的生物納米復(fù)合物在外加磁場(chǎng)作用下聚集在ITO電極表面。該方法應(yīng)用于紅甜椒樣品的檢測(cè)，與商用ELISA方法比對(duì)，獲得穩(wěn)定的結(jié)果，且無需樣品的預(yù)濃縮。Owino等[17]提出一種無需標(biāo)記的檢測(cè)方法，將BSA-AFB1固定在聚硫堇和金納米顆粒修飾的玻碳電極表面，用HRP封閉活性位點(diǎn)，免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗原-抗體結(jié)合物抑制了酶的活性。

Sharma等[24]和Singh等[25]制備出一種無需酶或其他標(biāo)記物的基于納米材料的傳感器，實(shí)現(xiàn)AFB1的快速檢測(cè)。Sharma等[24]將anti-AFB1抗體與半光胺功能化的金納米顆粒共價(jià)交聯(lián)形成anti-AFB1-C-AuNP，固定在金電極表面的自組裝單層膜上，用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法檢測(cè)溶液中的AFB1。Singh等[25]將anti-AFB1抗體固定在多壁碳納米管修飾的ITO電極上，利用循環(huán)伏安法檢測(cè)。結(jié)果顯示響應(yīng)電流隨AFB1濃度增大而增大[24-25]，分析原因認(rèn)為，抗原和抗體的結(jié)合可促進(jìn)空間定向，為到電極表面的電子轉(zhuǎn)移提供更便利的導(dǎo)電通道[25]，或抗原抗體復(fù)合物作為電子轉(zhuǎn)移加速層，更易于電子轉(zhuǎn)移[24-25]。但是，這與Zhou等[29]、孫秀蘭等[30]和Bacher等[36]分析結(jié)果時(shí)提到的抗原-抗體結(jié)合物阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移相悖。

Masoomi等[26]提出一種基于“夾心”結(jié)構(gòu)的電流型電化學(xué)生物傳感器，用金包裹Fe3O4磁芯與苯鄰二酚結(jié)合共同標(biāo)記二抗，苯鄰二酚被氧化產(chǎn)生響應(yīng)電流。通過外加磁場(chǎng)去除免疫復(fù)合物即可實(shí)現(xiàn)該傳感器的再生。“夾心”結(jié)構(gòu)一般適用于檢測(cè)生物大分子，不適合于檢測(cè)霉菌毒素這樣的生物小分子[40]。所以，在已發(fā)表的黃曲霉毒素生物傳感器文獻(xiàn)中極少采用“夾心”結(jié)構(gòu)。

不基于免疫分析的電流型生物傳感器主要利用了黃曲霉毒素對(duì)AChE的活性抑制作用[19-20]或黃曲霉毒素氧化還原酶(aflatoxin-oxidase，AFO)對(duì)黃曲霉毒素的催化氧化作用[27]，亦或不使用酶，直接利用電化學(xué)溶出分析技術(shù)[28]。

AFB1對(duì)AChE的活性抑制主要是由于AFB1與AChE活性位點(diǎn)入口的外圍位點(diǎn)結(jié)合，“堵住”了活性位點(diǎn)的入口，使得底物硫代乙酰膽堿無法進(jìn)入到催化位點(diǎn)，降低了AChE的去乙酰作用，阻止了膽堿的釋放，從而抑制了硫代乙酰膽堿的水解[19]。Rejeb等[20]制備出一種基于AChE和膽堿氧化酶(choline oxidase，ChOx)的雙酶?jìng)鞲衅鳌hOx固定在普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，AChE催化底物乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸，ChOx催化膽堿氧化生成的H2O2被電極表面的普魯士藍(lán)還原產(chǎn)生電流。結(jié)果顯示，AFB1濃度越高對(duì)AChE活性的抑制越大，當(dāng)抑制率為20%時(shí)，檢測(cè)下限為10 ng/g。Hansmann等[19]提出一種基于單酶的傳感器，將Ee-AChE(Electrophorus electricus AChE)固定在鈷-苯二甲藍(lán)修飾的電極上，鈷-苯二甲藍(lán)氧化硫代乙酰膽堿的水解產(chǎn)物硫代膽堿，產(chǎn)生氧化還原電流。在多種AChE中，Ee-AChE對(duì)AFB1表現(xiàn)出的敏感性最高，等量的AFB1情況下Ee-AChE獲得的抑制率最大[19]。基于AChE活性抑制的傳感器靈敏度較低，檢測(cè)下限一般為10～100 μg/kg，只有在對(duì)測(cè)試液預(yù)濃縮的前提下才能獲得更低的檢測(cè)下限[41-42]。另外，該類傳感器對(duì)AFB1的選擇性不唯一，因?yàn)锳FB1和AFB2對(duì)AChE都有較大的活性抑制作用，但是AFM1、AFG1和AFG2對(duì)AChE的抑制性很小[21]。因此，可以利用該類傳感器檢測(cè)AFB1和AFB2的總量。目前，大多數(shù)基于AChE活性抑制的生物傳感器仍處于概念驗(yàn)證階段，實(shí)際檢測(cè)中具有相對(duì)局限性[42]。

Li等[27]利用AFO對(duì)AFB1的催化氧化作用制備傳感器，將AFO固定在多壁碳納米管修飾的鉑電極上，AFO作用于AFB1分子雙呋喃環(huán)的不飽和碳鍵，生成O2和H2O2。AFO是來自假蜜環(huán)菌的具有轉(zhuǎn)化分解黃曲霉毒素作用的蛋白質(zhì)酶，可以與雜色曲霉素發(fā)生交叉反應(yīng)[43]，所以該傳感器對(duì)AFB1的選擇性不唯一。

Hajian等[28]提出一種基于吸附陰極溶出伏安法的電流型生物傳感器。使用懸汞電極作為工作電極，AFB1和AFB2吸附在懸汞電極表面，富集時(shí)間優(yōu)化為60 s，采用伏安法陰極掃描，AFB1和AFB2從陰極溶出，根據(jù)溶出電流峰測(cè)定AFB1和AFB2濃度。

2 阻抗型電化學(xué)生物傳感器

阻抗型電化學(xué)生物傳感器主要是通過檢測(cè)電極表面發(fā)生生物識(shí)別反應(yīng)引起的電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化來測(cè)量分析物。電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)是研究傳感界面電特性并跟蹤界面反應(yīng)的一種有效方法。文獻(xiàn)報(bào)道的黃曲霉毒素阻抗型生物傳感器大多數(shù)基于免疫分析[29-32，36-37]，也有少量報(bào)道基于DNA探針[35]。這類傳感器的主要優(yōu)點(diǎn)是一般不需要酶標(biāo)記抗原或抗體[44]，也無需使用二抗放大信號(hào)，即可產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。

Zhou等[29]使用電沉積法制備出一種石墨稀/導(dǎo)電聚合物/金納米顆粒/離子液復(fù)合物膜，修飾在金電極表面，固定anti-AFB1抗體。抗原-抗體結(jié)合物阻礙電子轉(zhuǎn)移，使電極表面阻抗增大。孫秀蘭等[30]采用了類似的檢測(cè)方法，使用溶膠凝膠法將anti-AFB1抗體固定在玻碳電極表面。Bacher等[36]使用一對(duì)銀絲電極組成的兩電極系統(tǒng)，將anti-AFM1抗體固定在電極表面的自組裝單層膜上。Li等[32]制備出一種硅膠-離子液生物相容性膜用于anti-AFB1抗體的固定，阻抗分析顯示，與不含離子液的比對(duì)電極相比，離子液的使用能夠增大玻碳電極表面的導(dǎo)電性，減小電子轉(zhuǎn)移阻抗。Owino等[31]將anti-AFB1抗體固定在聚苯胺和聚苯乙烯磺酸修飾的鉑圓盤電極表面，阻抗分析顯示抗體固定和BSA封閉都會(huì)阻礙電子轉(zhuǎn)移。Vig等[37]提出一種基于膠體金和電沉積銀的傳感器，固定在絲網(wǎng)印刷電極上的BSA-AFM1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的anti-AFM1抗體，在金的催化作用下，用計(jì)時(shí)電流法還原底液中的AgNO，電沉積銀在電極表面，從而改變電子轉(zhuǎn)移阻抗。

Din?kaya等[35]制備出一種基于DNA探針的阻抗型生物傳感器。該傳感器將硫醇修飾的單鏈DNA(ss-HSDNA)探針通過與金納米顆粒共價(jià)交聯(lián)固定在金電極表面形成的自組裝單層膜上，ss-HSDNA能夠識(shí)別待測(cè)液中的AFM1分子，發(fā)生特異性結(jié)合，增大電子轉(zhuǎn)移阻抗。

3 電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器

電導(dǎo)型電化學(xué)傳感器有時(shí)被看作是阻抗型電化學(xué)傳感器的一個(gè)分支[45]。通常，這類傳感器不需要使用參比電極，采用一對(duì)相隔一定距離的金屬電極，電極上施加交流電壓，產(chǎn)生電流[46]。溶液中發(fā)生的生物化學(xué)反應(yīng)會(huì)改變?nèi)芤旱碾x子組成和離子濃度，檢測(cè)由此而引起的電極間電導(dǎo)變化從而確定分析物的濃度。電導(dǎo)型傳感器的優(yōu)勢(shì)主要有：易于微型化和大規(guī)模生產(chǎn)，無需參比電極，驅(qū)動(dòng)電勢(shì)低[18]。

Liu等[18]提出一種基于金微叉指電極和HRP的免疫傳感器。anti-AFB1抗體固定在金納米顆粒和氨基乙硫醇修飾的金微叉指電極表面，用HRP封閉剩余的活性位點(diǎn)。電極表面免疫反應(yīng)形成的抗原-抗體結(jié)合物阻礙了固定的HRP到電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，抑制了酶的生物催化活性，從而影響HRP對(duì)底液中KI和H2O2的催化反應(yīng)，電解質(zhì)電導(dǎo)的變化與AFB1濃度成反比。Soldatkin等[34]制備出一種基于金叉指薄膜電極和AChE活性抑制的傳感器，并與ELISA、HPLC和TLC檢測(cè)方法進(jìn)行了比對(duì)。試驗(yàn)采用差分模式，使用2對(duì)電極，一對(duì)電極覆蓋無抑制反應(yīng)的BSA膜作為比對(duì)電極，另一對(duì)電極覆蓋AChE膜作為工作電極。AChE催化底物的水解，使電極薄膜上的離子濃度增大，從而使溶液電導(dǎo)發(fā)生變化。

Ah等[33]提出一種利用硅場(chǎng)效應(yīng)晶體管檢測(cè)不帶電或微弱帶電小分子的免疫傳感器。BSA-AFB1被固定在p型硅場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器表面源極和漏極之間的硅通道上，金納米顆粒標(biāo)記anti-AFB1抗體。競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)后被捕獲在傳感器表面的金納米顆粒通過化學(xué)金沉積迅速生長(zhǎng)并帶負(fù)電荷，使源極和漏極之間的電導(dǎo)增大。試驗(yàn)在干燥條件下測(cè)量金沉積反應(yīng)前后的電導(dǎo)值，獲得的信號(hào)放大是液體環(huán)境中的100倍，而且不需要考慮待測(cè)樣品溶液的離子強(qiáng)度、等電點(diǎn)或pH值。

4 電勢(shì)型電化學(xué)生物傳感器

電勢(shì)型電化學(xué)傳感器通過檢測(cè)工作電極和參比電極之間電流為零時(shí)的電勢(shì)變化與電化學(xué)反應(yīng)中離子活性的關(guān)系來測(cè)量分析物。由于在某種程度上，電勢(shì)型和電導(dǎo)型傳感器信噪比較低，在實(shí)際應(yīng)用中不如電流型那么廣泛[44]。

Rameil等[16]采用免疫分析方法，將多克隆anti-AFM1抗體固定在聚吡咯修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，羥基苯丙酸作為向抗原標(biāo)記物HRP提供電子的復(fù)合物，測(cè)試底液中含H2O2，結(jié)果顯示電勢(shì)變化隨AFM1濃度增大而減小。Larou等[38]首次研制出一種用于AFM1檢測(cè)的基于生物電識(shí)別分析的高通量電勢(shì)型細(xì)胞生物傳感器。AFM1同源抗體電植入非洲綠猴腎細(xì)胞的細(xì)胞膜中，銀絲工作電極和參考電極插入待測(cè)液中，AFM1與細(xì)胞膜中的抗體結(jié)合，使細(xì)胞膜電勢(shì)發(fā)生改變。由于使用多細(xì)胞電極接口陣列，該傳感器可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，每小時(shí)完成160次獨(dú)立測(cè)試。

5 實(shí)際樣品前處理方法

實(shí)際樣品的前處理也會(huì)影響傳感器的檢測(cè)靈敏度，所以，在檢測(cè)之前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。相對(duì)于傳統(tǒng)TLC法和HPLC法，應(yīng)用電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)方法中樣品前處理過程步驟簡(jiǎn)單、使用有機(jī)試劑少、成本低、易于操作。對(duì)于固體樣品，如花生、玉米、大米和大麥等，前處理一般分為4個(gè)步驟[6-10，15，30]：1)將樣品磨成粉；2)加入不同濃度的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦混合；3)加入提取液，離心機(jī)離心；4)取上清液，用緩沖溶液稀釋后待測(cè)。Zhou等[29]和Li等[32]在前處理后，取萃取物，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋5倍，混懸液手動(dòng)搖晃分層后，水相層用于AFB1檢測(cè)。Piermarini等[8]增加脫脂步驟，用正己烷脫脂1次，待溶液分層后，收集水相層用于檢測(cè)。提取液一般使用甲醇、十二甲基甲酰胺和磷酸鹽緩沖溶液(70∶1∶29，V/V)[6，30]，或甲醇和水(80∶20，V/V)[7，15]，亦或甲醇和磷酸鹽緩沖溶液(85∶15，V/V)[8，10，29，32]。

對(duì)于牛奶液體樣品，前處理一般分為2個(gè)步驟[11-13，16，35]：樣品離心脫脂和加入不同濃度的AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)于奶粉固體樣品，前處理過程增加樣品溶解于緩沖溶液的步驟[36-37]。

6 展望

隨著傳感技術(shù)、材料科學(xué)、生物技術(shù)的發(fā)展，黃曲霉毒素電化學(xué)生物傳感器也呈現(xiàn)出一些引人注目的發(fā)展趨勢(shì)。

納米材料在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。納米材料，如碳納米管、金屬納米顆粒、納米線等，它們具有比表面積大、穩(wěn)定性好、生物兼容性好、易于功能化、易于分散和快速制備、尺寸和形狀多樣等優(yōu)點(diǎn)[44]。功能化的納米材料可以作為催化工具、固定平臺(tái)或電活性標(biāo)記等，用于改善生物傳感器的表面特性[23]。金屬納米顆粒，特別是金納米顆粒是廣泛使用的一種納米材料。例如，金納米顆粒與聚硫堇的電聚合薄膜[17]、2-氨基乙硫醇[18]、全氟磺酸中的離子液[14]、殼聚糖[26]或石墨烯[29]共同修飾工作電極。金納米顆粒也可以與抗體結(jié)合，例如，金納米顆粒標(biāo)記anti-AFB1抗體，作為催化劑催化電沉積銀[37]，或者在干燥檢測(cè)條件下放大響應(yīng)信號(hào)[33]，亦或者與半胱胺一起共價(jià)交聯(lián)anti-AFB1抗體，用于抗體固定[24]。另外在DNA生物傳感器中，金納米顆粒用于固定硫醇修飾的單鏈DNA探頭[35]。碳納米管也是一種常用的納米材料，例如，多壁碳納米管修飾鉑電極，用于固定黃曲霉毒素氧化酶[27]，或者多壁碳納米管沉積在ITO電極上，用于固定anti-AFB1抗體[25]。

實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)檢測(cè)也是未來的一個(gè)發(fā)展方向。在傳感器陣列的不同行或不同列固定不同分析物的抗體，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)或多靶標(biāo)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)，從而提高系統(tǒng)通量、降低分析成本、節(jié)省時(shí)間。例如，使用96孔絲網(wǎng)印刷微板[8，11]或8個(gè)絲網(wǎng)印刷電極[9]組成的傳感器陣列，用于檢測(cè)AFB1或AFM1。但是，目前黃曲霉毒素的研究仍然停留在同一樣品的同時(shí)重復(fù)檢測(cè)。

轉(zhuǎn)換器本身性能的改進(jìn)對(duì)提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度也具有重要的意義。微電極或超微電極的使用能夠加快傳質(zhì)，加速響應(yīng)時(shí)間，大大提高傳感器的靈敏度，具有許多常規(guī)電極無法比擬的優(yōu)良性能。例如，使用微梳狀電極檢測(cè)AFB1[18]，或采用金微電極陣列(含有35個(gè)20 μm×20 μm的正方形微電極)與片上參考電極和對(duì)電極組成片上系統(tǒng)用于檢測(cè)牛奶樣品中的AFM1[13]。

另外，研究和開發(fā)用于黃曲霉毒素檢測(cè)的微流控系統(tǒng)和免疫芯片技術(shù)，優(yōu)化分析機(jī)制，合成新型重組抗體和適體，以及研究和識(shí)別人類黃曲霉毒素暴露的獨(dú)特生物標(biāo)記都將成為未來黃曲霉毒素電化學(xué)生物傳感器研究的發(fā)展方向，并將對(duì)食品安全產(chǎn)生深遠(yuǎn)的積極影響。

7 結(jié)論

在文獻(xiàn)報(bào)道的黃曲霉毒素生物傳感器中，電化學(xué)生物傳感器成為眾多研究的焦點(diǎn)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，電化學(xué)生物傳感器具有成本低、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備便于微型化、易于實(shí)現(xiàn)移動(dòng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。其中，電流型免疫傳感器是最成熟、應(yīng)用最廣泛的一種生物傳感器，隨著超微電極、超微電極陣列以及電極修飾材料和技術(shù)的發(fā)展，電流型電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和選擇性將不斷提高。阻抗型電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)中通常不需要酶標(biāo)記抗原或抗體，也無需使用二抗放大信號(hào)，這樣避免了酶的不穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高了傳感器的可重復(fù)性，簡(jiǎn)化了操作步驟。電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器不需要使用參比電極，優(yōu)化了電極結(jié)構(gòu)，易于微型化和大規(guī)模生產(chǎn)。但是，在某種程度上，電勢(shì)型和電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器由于信噪比較低，在實(shí)際應(yīng)用中不如電流型那么廣泛。

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Recent Developments and Applications of Electrochemical Biosensors for Aflatoxins Detection

Ma Haihua1，2，3，4Zhang Yuan1，4Zhen Tong3Sun Jizhou1Xia Shanhong1

(State Key Laboratory of Transducer Technology，Institute of Electronics，Chinese Academy of Sciences1，Beijing 100190)(Graduate University of Chinese Academy of Sciences2，Beijing 100080)(College of Information Science and Engineering，Henan University of Technology3，Zhengzhou 450001)(Key Laboratory of Grain Information Processing and Control of Ministry of Education4，Zhengzhou 450001)

Aflatoxins are produced as secondary metabolites by the fungiAspergillusflavusandAspergillusparasiticus，which are known to be potent toxic，carcinogenic，teratogenic and mutagenic.The intake of agriculture products and food contaminated by aflatoxins may significantly threaten to the health of human and animals.On the basis of the researches all over the world over the past decade，this review gives a general overview of development situations and application prospects of electrochemical biosensors in aflatoxins detection，focusing on the electrochemical sensing mechanisms，fabrication methods and detection performances.Compared with the traditional methods for detecting aflatoxins，electrochemical biosensors have the advantages of fast，simple，low-cost，easy of miniaturization and so on.The use of gold nanoparticles，carbon nanotubes and other nanomaterials will further increase the sensitivity of the electrochemical biosensors and the immobilization efficiency of the antigens or antibodies.Meanwhile，ultramicroelectrodes，sensor arrays and microfluidics will also improve the sensors’ performances for toxins detection.

aflatoxins，electrochemistry，biosensor，immunoassay，nanomaterial

O657.1；TP212.3

A

1003-0174(2016)02-0132-09

863計(jì)劃(2012AA101608)，國(guó)家自然科學(xué)基金(6140 1433)

2014-06-18

馬海華，女，1979年出生，講師，博士，生化微傳感器

張?jiān)校?961年出生，教授，博士生導(dǎo)師，智能信號(hào)處理與微系統(tǒng)技術(shù)