原料體系對高水分組織蛋白纖維化結構的影響

洪 濱 解鐵民 高 揚 李哲濱 張英蕾 張莉莉 李家磊 盧淑雯

(黑龍江省農業科學院食品加工研究所，哈爾濱 150086)

原料體系對高水分組織蛋白纖維化結構的影響

洪 濱 解鐵民 高 揚 李哲濱 張英蕾 張莉莉 李家磊 盧淑雯

(黑龍江省農業科學院食品加工研究所，哈爾濱 150086)

以大豆分離蛋白和小麥蛋白作為混合原料，在大豆分離蛋白質量分數為0%～75%，含水量為60%～70%，擠壓溫度為120～160 ℃條件下，采用三因素五水平試驗設計方法，擠壓加工高水分組織化蛋白。根據不同溶液體系中的蛋白質溶解度，確定溶解化學鍵類型，分析各種化學鍵交聯對組織蛋白分子結構的影響。結果表明，以大豆分離蛋白和小麥蛋白為原料擠壓生產高水分組織蛋白的過程中，二硫鍵是維持蛋白聚合物結構的主要化學鍵。水分含量與二硫鍵形成正相關，但與疏水鍵形成負相關；而溫度在140～150 ℃之間組織蛋白產品形成大量化學鍵，組織化程度高；原料體系中分離蛋白含量增加有利于組織蛋白結構中各化學鍵的形成，可改善蛋白產品形成良好的組織化狀態。

高水分組織蛋白 分子間作用力 化學鍵 組織化

高水分擠壓蛋白是以大豆分離蛋白、谷朊粉、低溫脫脂豆粕等為主要原料，采用單(雙)螺桿擠壓技術進行高溫短時加工，生產出含水量在50%以上的蛋白制品，呈現類似肉的纖維結構。采用高濕擠壓加工技術生產的高水分大豆蛋白制品，富含氨基酸、低膽固醇含量、有“肉感”纖維等優點，是理想的大豆食品，成為大豆深加工的重點發展方向。為了發揮擠壓加工工藝優勢，學者們已從工藝優化[1]、設備設計[2]和擠壓產品品質評價[3]等方面進行了系統研究工作，目前的重點集中在擠壓過程中蛋白內部發生的化學反應上，揭示擠壓加工過程中高水分組織蛋白纖維化結構形成機理，從本質上控制大豆擠壓高濕產品的質量。

研究發現高水分擠壓大豆蛋白形成的高分子聚合物溶解度低，氫鍵、疏水鍵和二硫鍵的存在及它們的共同作用是穩定聚合物組織化結構的主要作用[4]；在花生蛋白高水分擠壓加工過程中，蛋白質疏水作用和氫鍵存在對其組織化結構的形成起主要作用，其次是二硫鍵[5]；以大豆分離蛋白為原料的高水分擠壓研究結果表明，疏水作用與二硫鍵交互作用、氫鍵與二硫鍵交互作用對維持產品結構有較大的影響[6]。在低水分擠壓蛋白方面，通過研究大豆蛋白熱塑擠壓組織化結構的形成規律，推斷肽鍵可能是導致大豆蛋白產生組織化結構形成的主要原因[7]；也有學者認為蛋白產品中含有的硫化物形成的二硫鍵對其組織化結構的形成起主要作用[8]。以大豆濃縮蛋白(SPC)為原料擠壓加工組織化蛋白，分析表明擠壓組織化改性過程中發生二硫鍵交聯反應、靜電作用和疏水作用，這些力作用形成了組織化蛋白的空間構象[9]。在以小麥粉為原料進行擠壓，二硫鍵是形成蛋白聚合物的主要化學鍵，模頭溫度為120～160 ℃時，二硫鍵形成，且在160 ℃數量最多[10]。

由于擠壓加工條件不同、原料中蛋白質種類差異及含水量變化，擠壓蛋白內化學鍵對其組織化結構形成的作用機理迥然不同。本研究以大豆分離蛋白和小麥蛋白混合料作為原料，擠壓加工高水分組織蛋白，研究混合原料中2種蛋白不同配比量和擠壓溫度對擠壓蛋白狀態影響規律，揭示化學鍵對擠壓蛋白結構形成作用機理，內容上突破了多以單一原料為對象，不能合理解釋混合原料對化學鍵形成規律的局限性。研究結果為優化高水分蛋白擠壓加工工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白：蛋白質質量分數83.72%，含水量7.17%，灰分7.00%，脂肪1.00%，購自哈高科大豆食品有限責任公司。

小麥蛋白：蛋白質質量分數72.33%，含水量8.90%，脂肪1.25%，灰分1.50%，購自陜西聚梁食品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擠壓設備

擠壓設備為同向雙螺桿擠壓機(ClextralEV25，法國)，螺桿直徑(D)為25 mm，長徑比24∶1，有6節套筒，可單獨控制每節的溫度，擠壓機配有1個直徑4 mm的模孔。從出口端到喂料端螺桿配置(見圖1)依次為0.5D/5.5D(螺距/螺桿長)單線螺桿，0.25D/0.25D變線元件，1D/1D(90°)攪拌元件，0.5D/0.5D反向螺桿，0.5D/1.5D雙線螺桿，0.75D/10.5D雙線螺桿，1D/1D雙線螺桿，1.25D/3.75D雙線螺桿。帶有冷卻水的模頭，可使模頭溫度控制在60 ℃， 出口寬7 cm、高4 mm。

注：A=0.25D/0.25D；B=1D/1D(90°)；C=0.5D/0.5D；D=0.5D/1.5D；E=1D/1D。

圖1 擠壓機螺桿配置圖

1.2.2 樣品準備與數據采集

啟動擠壓機，調節到試驗設計表中確定的擠壓條件，調節液體喂料量以滿足產品不同的含水量，待每個參數下機器穩定20 min后，開始記錄擠壓機扭矩、變速箱壓力、模頭溫度等數據。設定自動采集數據時間間隔為每秒1次，取穩定后30 s的數據，計算其平均值。對各條件下樣品，取0.5～1.0 kg，用真空包裝機封裝后，放入冰箱內保藏(4 ℃)，用于后續化學鍵交聯分析。

1.2.3 蛋白溶解度及化學鍵交聯的分析

浸提溶液制備：① 0.035 mol/L pH 7.6，磷酸鹽緩沖液(P)；② pH 7.6，P+1.5%(m/V)SDS(S)；③ pH 7.6，P+0.1 mol/L 2-ME(M)；④ pH 7.6，P+8 mol/L尿素(U)；⑤ pH 7.6，P+1.5% SDS+0.1 mol/L 2-ME；⑥ pH 7.6，P+8 mol/L尿素+1.5% SDS；⑦ pH 7.6，P+8 mol/L 尿素+0.1 mol/L 2-ME；⑧ pH 7.6，P+8 mol/L 尿素+0.1 mol/L 2-ME+1.5% SDS。

蛋白質浸提：依據文獻[5-6,11]的方法進行。取0.50 g原料和凍干擠出樣品蛋白質粉末(浸提前測定水分含量)，分別加入10 mL上述不同的浸提溶液中，室溫下在水平振蕩搖床上浸提2 h，然后4 500 r/min離心10 min，取上清液。向沉淀物中再次加入10 mL溶液，重復上述浸提和離心程序，合并2次上清液于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。原料和擠出樣品中總的蛋白質含量采用凱氏定氮法測定，上清液中可溶性蛋白含量，采用Lowery法測得(測定波長750 nm)。試驗重復3次，結果用平均值。蛋白質溶解度(g/g)=溶出蛋白含量/樣品中總蛋白含量。

依據Hager[8]提出的方法，如表1所示，根據不同溶液體系中的蛋白質溶解度，確定溶解化學鍵類型及各種化學鍵交聯。

表1 不同溶液體系中的溶解化學鍵類型

1.3 試驗設計

以大豆分離蛋白和小麥蛋白2種原料作為混合料，改變混合料中2種原料比例，構成不同的混合料中分離蛋白的含量(見表2)。

試驗設計采用三因素五水平正交設計(水平編碼見表2)，3個因素為分離蛋白含量、含水量和套筒溫度。試驗數據用統計分析軟件SPSS18進行數據處理，采取線性模型逐步回歸和向后回歸方法建立最優模型，剔除P<0.05水平的不顯著項。

式中：Y(蛋白溶解度)是響應值，X1=分離蛋白含量，X2=含水量，X3=套筒溫度。

表2 試驗水平編碼表

2 結果與分析

2.1 蛋白溶解度

2.1.1 不同溶解體系下的蛋白溶解度

SDS、尿素和巰基乙醇試劑分別破壞蛋白質分子之間的疏水鍵、氫鍵和二硫鍵[7-8,12-13]，23組擠壓樣品分別置入不同化學鍵破壞試劑中，其溶解度結果見表3。各組樣品在磷酸緩沖液(P)中的溶解度都很低，表明原料在經高溫、高壓、高剪切擠壓處理后發生顯著變性，形成了大分子量聚合物。從表3中可以看出各組樣品在P+M、P+S+M、P+U+M、P+U+M+S中的溶解度顯著高于其他試劑中的溶解度，這表明以大豆分離蛋白和小麥蛋白為原料生產的組織蛋白中，二硫鍵對維持其結構的貢獻最大，主要取決于二硫鍵是蛋白聚合物中主要的共價鍵[13]，能夠保證擠壓蛋白結構穩定性[14-15]。從S和U試劑中較低的溶解度可以看出，氫鍵和疏水鍵對組織化蛋白結構的作用相對較小，但各樣品在U+S+M混合試劑中的溶解度最大，說明疏水作用、氫鍵和二硫鍵的交互作用對維持擠壓產品結構的貢獻最大。

表3 各試劑中蛋白質的溶解度

注：表中各數值均為蛋白溶解度，單位為%。

2.1.2 含水量對蛋白化學交聯的影響

不同含水量擠壓組織化產品中各種化學鍵作用結合的蛋白質溶解度見圖2，結果表明各試劑中蛋白質的溶解度隨著含水量的增加而增加。含水量對二硫鍵影響最大，在60%的水分條件下形成的二硫鍵含量最低，M試劑中的溶解度僅為29.59%，從表4中也可以看出含水量對二硫鍵的影響差異顯著(P<0.01)，可以推斷含水量在60%以下時，二硫鍵的形成數量會減少。在低水分條件下，S試劑中的溶解度升高，表明含水量降低引起蛋白內部的疏水鍵數量增加，含水量下降一定程度，疏水鍵有可能取代二硫鍵，成為維持蛋白結構主要的化學鍵。

圖2結果表明，M+S、M+U、M+U+S中溶解度沒有顯著變化(P>0.01)，表明含水量會顯著影響氫鍵、二硫鍵、疏水鍵的形成，但對二硫鍵、疏水與二硫鍵之間的交互作用影響較小。由此可知，含水量有助于蛋白質的伸展變性，而對共價鍵、非共價鍵及其二者交互作用的影響存在差異。

圖2 擠壓組織蛋白的溶解度隨著含水量的變化

2.1.3 溫度對蛋白化學交聯的影響

圖3是不同擠壓溫度擠壓組織化產品中各種化學鍵作用結合的蛋白質溶解度。從圖3可以看出，套筒溫度在120～130 ℃之間，擠壓蛋白產品在各試劑中的溶解度無顯著差別，表明此段溫度對擠壓組織蛋白產品中各化學鍵的形成沒有顯著影響；套筒溫度在130～160 ℃之間，4種試劑引起的擠壓組織蛋白溶解度差異顯著，表明組織蛋白內部形成大量化學鍵，但在150 ℃溫度下擠壓得出的產品形成更多化學鍵[16]，擠壓蛋白的組織化程度優于其他溫度水平[17]。

圖3 擠壓組織蛋白的溶解度隨著溫度的變化

2.1.4 原料中分離蛋白添加量對蛋白化學交聯的影響

圖4是在各種化學鍵作用下擠壓組織蛋白的溶解度隨著原料中分離蛋白含量的變化。從圖中可以得到，隨著混合原料中分離蛋白含量的增加，在不同試劑作用下的擠壓組織蛋白質的溶解度明顯上升，表明增加大豆分離蛋白添加量可以促進組織蛋白產品中產生多種化學鍵，且大豆分離蛋白比小麥蛋白更有利于形成高水分組織化蛋白組織化結構，這樣在原料中可以增加大豆分離蛋白的含量改善蛋白產品組織化狀態。由表4還可以看出，大豆分離蛋白含量與二硫鍵、疏水作用、氫鍵組合(SUM)和疏水作用、二硫鍵組合(SM)正相關程度最大，其次是二硫鍵作用，最低是二硫鍵與氫鍵組合(UM)。

圖4 擠壓組織蛋白的溶解度隨著原料中分離蛋白含量的變化

2.2 化學鍵交聯的分析

從表4中化學鍵的回歸系數顯著性可以看出，二硫鍵只與含水量成正相關，疏水作用只與含水量成負相關，氫鍵與此體系下的3個因素差異都不顯著。在2種分子作用力相互作用方面，疏水作用與二硫鍵的共同作用與含水量成正相關；二硫鍵和氫鍵的共同作用與含水量和含水量與溫度的交互作用成負相關；分離蛋白濃度、含水量、溫度對二硫鍵與氫鍵的共同作用具有顯著影響，相關系數0.803。

表4 化學鍵的回歸系數

注：X1：分離蛋白含量，X2：含水量，X3：溫度。ns：沒有顯著性差異。顯著性差異*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

擠壓組織蛋白中分子間的作用力(疏水作用+二硫鍵+氫鍵)與分離蛋白濃度、含水量、溫度、分離蛋白和含水量的交互作用、分離蛋白和溫度的交互作用成正相關，與分離蛋白平方項和溫度平方項成負相關。模型的相關系數為0.867，因此通過這3個因素可以很好地描述在此原料體系下分子間作用力的影響情況，方程擬合較好。

3 結論

二硫鍵是維持蛋白聚合物結構的主要化學鍵，二硫鍵溶解液中的蛋白溶解率最高，幾乎都在50%以上。原料中大豆分離蛋白的質量分數在60%～70%之間時，蛋白溶解度更高，接近于65%，可以推斷,增加原料中大豆分離蛋白的含量可以促進組織蛋白結構中各化學鍵的形成。物料含水量對分子內部化學鍵的影響非常明顯，含水量降低會限制二硫鍵的形成，但可以促進疏水鍵的形成。套筒溫度在140～150 ℃之間組織蛋白產品形成的化學鍵最多，組織化程度最好。

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The Effect of Raw Material System on Fibrous Structure for High Moisture Textured Protein

Hong Bin Xie Tiemin Gao Yang Li Zhebin Zhang Yinglei Zhang Lili Li Jialei Lu Shuwen

(Food Processing Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Haerbin 150086)

To determine the effect of raw material system on fibrous structure for high moisture textured protein, soy isolate protein (SPI) and wheat protein selected as mixed material, a combination experimental method with three factors and five levels was employed to extrude and process high moisture tissue protein in the conditions of the SPI ratio of 0%～75%, moisture content of 60%～70% and extruded temperature of 120～160 ℃. According to the solubility of protein in the solution system, types of chemical bonds were determined to analyze the effect of chemical bonds linkage on the molecular structure of tissue protein. The results showed that disulfide bond plays the key role to maintain the polymeric structure of protein in the extrude processing of high moisture tissue protein from the mixture of SPI and wheat protein. Moisture content in raw material had a positive correlation with the formation of disulfide bond and the negative correlation with the formation of hydrophobic bond. Extruded temperature in 140～150 ℃ resulted in a large number of chemical bonds to improve the tissue degree within tissue protein. The addition of SPI in raw material favored in the formation of chemical bonds within tissue protein to improve protein product and form satisfactory texturization state.

high moisture meat analogue，intermolecular bond，chemical bonding，degree of texture.

S52

A

1003-0174(2016)02-0023-05

黑龍江省青年基金(QC2020118)，黑龍江省自然基金重點項目(20080101)

2014-07-04

洪濱，男，1984年出生，助理研究員，碩士，農產品加工

盧淑雯，女，1968年出生，研究員，博士，農產品加工