擠壓膨化脫脂處理對高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響

齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 丁 儉 李 楊 江連洲 王勝男

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

擠壓膨化脫脂處理對高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響

齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 丁 儉 李 楊 江連洲 王勝男

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

擠壓膨化 高溫豆粕 多肽 抗氧化性

高溫豆粕經過不同蛋白酶水解可降解為可溶性蛋白和多肽的混合物，通過進一步的分離純化得到的豆粕多肽具有溶解性高、黏度低、穩定性強等功能特性及降血糖、降血壓等生理活性[1]。此外，豆粕多肽還具有良好的抗氧化性[2]。近年來擠壓膨化在油脂和生物活性肽的提取和制備方面都得到了較好的應用[3]，在擠壓膨化過程中，高溫、高壓和高剪切作用，使物料的結構和組織狀態發生變化，其中蛋白質發生適度變性伸展，暴露出更多的作用位點，增加了對蛋白酶的敏感性，利于蛋白質水解成多肽[4]。同時，擠出物的理化性質和生物活性受到擠壓膨化中物理作用與化學作用的共同影響[5]。Choudhury 等[6]研究了雙螺桿擠壓技術在抗氧化性食品上的應用，從顯微結構上研究了膨脹比、剪切應力、剪切強度、密度和粘度與抗氧化性的關系。江連洲等[7]采用擠壓膨化預處理水酶法提取大豆多肽，并應用響應面法對大豆擠壓膨化后水酶法提取多肽的最佳工藝進行優化，比相同酶解條件下未經擠壓膨化預處理大豆多肽得率有顯著提高。

電子自旋共振(ESR)光譜儀，主要用于包含有未成對電子的順磁性物質的研究，已在地質學、物理學、生物醫藥學等方面得到了廣泛應用[8]，特別是近些年來許多學者將ESR應用于測定抗氧化劑對自由基的清除作用，該方法主要應用于水溶性成分對自由基的清除活性。

為了提高豆粕蛋白資源的利用率，降低豆粕多肽的生產成本，提高豆粕多肽的抗氧化性，本試驗利用酶法水解高溫豆粕制備豆粕多肽，再通過超濾處理分離出不同分子質量的多肽，研究擠壓膨化脫脂處理對高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響，為高溫豆粕的綜合利用及抗氧化蛋白多肽的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆片：哈爾濱市九三油廠；Alcalase 2.4L 堿性蛋白酶：novo公司；電子自旋捕獲劑(DMPO)：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

雙螺桿擠壓機：東北農業大學工程學院農產品加工試驗室自制；F2102型植物試樣粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；LDZ5-2型臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；LGJ-25型冷凍干燥機：上海醫用科學儀器廠；DU800型紫外分光光度計：美國貝克曼庫爾特有限公司；ESR 300E型波譜儀：德國布魯克公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

大豆片→擠壓膨化→脫脂→高溫脫溶→高溫豆粕→粉碎→豆粕粉→與水混合→酶解→滅酶→冷卻→調pH4.5→離心分離→豆粕多肽溶液→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→豆粕多肽

將原料大豆片經粉碎后，利用雙螺桿擠壓膨化機在不同條件下進行擠壓膨化處理，然后采用乙醚對擠壓膨化后的大豆片進行脫脂5 h，再放入90 ℃烘箱中高溫脫溶1 d得到高溫豆粕。將高溫豆粕粉碎后，以1:10的料液比與水混合，調節混合液溫度55 ℃、pH8.5，以20 000 U/g底物的加酶量加入Alcalase 2.4L堿性蛋白酶進行酶解4.5 h，迅速升溫到90 ℃，滅酶10 min。然后冷卻至室溫，用1.0 mol/L的HCl溶液調節pH至4.5，4 000 r/min離心15 min，收集上清液即為豆粕多肽溶液。將豆粕多肽溶液依次通過分子質量為1 ku和3 ku的平板膜。在室溫下，調節膜前壓力為1 MPa，膜后壓力為0.4 MPa，進行超濾處理，分別得到P1(分子質量>3 ku)、P2(分子質量1～3 ku)、P3(分子質量<1 ku)3種分子質量的豆粕多肽溶液，然后真空濃縮、冷凍干燥即得豆粕多肽。多肽得率為35%左右，將得到的多肽配成10 μg/mL的溶液進行抗氧化性分析。

1.2.2 擠壓膨化工藝單因素試驗

1.2.3 擠壓膨化工藝響應面優化試驗

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.4 豆粕多肽分子質量對其抗氧化性的影響

將得到的不同分子質量豆粕多肽P1(>3 ku)、P2(1～3 ku)、P3(<1 ku)，分別配成10 ug/mL的多肽溶液，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為對照，采用電子自旋共振(ESR)法測定豆粕多肽對·OH的清除作用。

1.3 測定方法

式中：A0表示空白組在波長322 nm的吸光度值；A1表示試樣組在波長322 nm的吸光度值。

1.3.2抑制脂過氧化自由基(ROO·)能力的測定

采用亞油酸脂質過氧化體系法[10]。取50 μL多肽溶液與974 μL蒸餾水，26 μL亞油酸，2 mL無水乙醇，2 mL 50 mmol的pH 7.0的磷酸緩沖液混合，40 ℃暗處反應12 h。取上述混合物50 μL加入0.8 mL的蒸餾水、0.2 mL 8.1% SDS、1.5 mL 20% pH 3.5的醋酸溶液、1.5 mL 0.8%巴比妥酸。將上述反應液在100 ℃加熱60 min，冷卻，在532 nm處測定吸光度值，以空白作參比。抑制ROO·能力按公式計算：

式中：A0表示抗氧化劑空白樣的吸光度；AS表示加抗氧化劑樣品的吸光度。

1.3.3 電子自旋共振(ESR)法測定羥自由基(·OH)清除率

參照Rosen等[11]的方法。羥基自由基由Fenton反應產生。50 μL不同分子質量豆粕多肽樣品或作為對照的等體積的pH7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)加入到50 μL 0.3 mol/L的DMPO和50 μL 10 mmol/L硫酸亞鐵中，再加入50 μL 10 mmol/L過氧化氫溶液啟動反應。將反應體系吸入密封的毛細管中，2.5 min后用Brucker ESR 300E波譜儀記錄ESR圖譜。測試條件：中心場強為351.194 mT，掃描寬度為10.00 mT，微波頻率為9.858 GHz，功率為2.25 mW。豆粕多肽對·OH的清除作用以清除率(%)表示，計算公式：

式中：HX為不同分子質量豆粕多肽的ESR圖譜信號強度；H0為對照組的ESR圖譜信號強度。

1.4 數據處理

采用SPSS17.0、Origin85和Design-Expert進行統計分析及數據處理。

2 結果與分析

2.1 擠壓膨化工藝單因素分析

圖1 物料含水量對高溫豆粕多肽抗氧化性的影響

圖2 套筒溫度對高溫豆粕多肽抗氧化性的影響

2.2 擠壓膨化工藝響應面分析

表2 響應面試驗方案及結果

表2(續)

Y1=45.05+0.82A+1.16B+0.45C+0.55D+0.28AB+0.11AC+0.57AD+0.76BC+0.06BD-0.54CD-1.02A2-0.87B2-1.04C2-0.30D2

表清除能力的方差分析結果

抑制ROO·能力Y2通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型為：

Y2=49.97+0.74A+0.40B+1.15C+0.61D+0.24AB+0.14AC+0.44AD+0.64BC-0.64BD+0.13CD-0.93A2-1.02B2-0.77C2-0.34D2

采用Design-Expert軟件對方程進行方差分析，抑制ROO·能力Y2的方差分析結果見表4。

表4 抑制ROO·能力的方差分析結果

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P>0.05)，并且該模型R2=96.58%，說明96.58%的變化能通過這個模型解釋，試驗誤差較小，模型成立，可以通過此模型對抑制ROO·能力進行預測和分析。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：C>A>D>B，即螺桿轉速>物料含水量>模孔孔徑>套筒溫度。

2.3 豆粕多肽分子質量對其抗氧化性的影響

由圖3可以看出，波譜呈現出典型的ESR測定·OH清除率的標準四峰情況。ESR法測定·OH清除能力，主要是考察ESR波譜中的第2峰的高度與空白對照品第2峰高度之間的關系。波譜中的第2峰越高，則清除能力越差，反之，第2個峰的高度越低，說明其清除能力越強[14]。通過·OH清除率公式的計算可知，當豆粕多肽分子質量分別為>3 ku、1～3 ku、<1 ku時，·OH清除率分別為67.56%、93.13%、99.00%，可見·OH清除率與豆粕多肽分子質量呈負相關。豆粕多肽分子質量<1 ku時，·OH清除率幾乎達到100%，可見豆粕多肽對·OH有很好的清除能力，尤其是小分子質量多肽的·OH清除能力尤為顯著。小分子質量多肽比大分子質量多肽具有更好的抗氧化活性，Saiyi Zhong等[15]研究表明，在其所研究的5個肽段中，小分子質量肽展現出了更好的抗氧化活性，其抗氧化活性與維生素E相似。

圖3 不同分子質量豆粕多肽的ESR圖譜

3 結論

[1]Schmidl M K, Taylor S L, Nordlee J A. Use of hydrolysatebased products in special medical diets[J]. Food Technology, 1994 10: 77-80

[2]俞偉輝, 陽建輝, 譚溪清，等. 酶法水解大豆蛋白的研究進展[J]. 飼料與畜牧，2008(8):26-28

Yu Weihui, Yang Jianhui, Tan Xiqing, et al. Research progress for enzymatic hydrolysis of soybean protein[J]. Feed and Husbandry, 2008(8):26-28

[3]Stephanie J, Abdullah A M. Low temperature dry extrusion and high-pressure processing prior to enzyme-assisted aqueous extraction of full fat soybean flakes[J]. Food Chemistry, 2009，114: 947-954

[4]Lin Chen, Jianshe Chen, Jiaoyan Ren, et al. Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(5): 887-897

[5]Mary E C. Chemical and Nutritional Changes in Food during Extrusion. In: Mian N. Riaz, Ph. D. edited. Extruders in Food Application[C]. New York, Technomic Publishing Company, 2000：127-142

[6]Choudhury M H, Chakraborty R, Raychaudhuri U. Application of twin screw extrusion technology for development of new generation snacks with antioxidant: An analysis[J]. Advances in Polymer Technology, 2013, 12(29): 24-32

[7]江連洲, 隋曉楠, 齊寶坤，等. 酶法水解大豆膨化料提取多肽的工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(14): 161-164

Jiang Lianzhou, Sui Xiaonan, Qi Baokun, et al. Enzymatic Extraction of Peptides from Extruded Soybean[J]. Food Science, 2011, 32(14): 161-164

[8]Cheng H Y, Lin T C, Yu K H, Yang, et al. Antioxidant and free radical scavenging activities of terminalia chebula[J]. Biol Pharm Bull, 2003, 26(9): 1331-1335

[9]王莉娟, 陶文沂. 大豆肽體外抗氧化活性研究[J]. 生物加工過程, 2008, 7(4): 69-73

Wang Lijuan, Tao Wenyi. Anti-oxidative effect of soybean peptides in vitro[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2008, 7(4): 69-73

[10]Huamin C, Koji M, Fumio Y. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. J Agric Food Chem, 1995，43: 574-578

[11]Rosen G M, Rauckman E J, Packer I L. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals[J]. Methods in Enzymology, 1984，105: 198-209

[12]Fujita Y, Noda Y. The effect of hydration on the thermal stability of ovalbumin as measured by means of differential scanning calorimetry[J]. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1981 54: 3233-3234

[13]Petra B W. Investigation of absorption-induced structural changes of proteins at solid/liquid interfaces by differential scanning calorimetry[J]. Thermochimica Acta, 2002, 382(1-2): 174-188

[14]Park P J, Je J Y, Kim S K. Free radical scavenging activities of differently deacetylated chitosans using an ESR spectrometer[J]. Carbohydrate Polymers, 2004，55: 17-22

[15]Saiyi Z, Changwei M, Young C L, et al. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry[J]. Food Chemistry, 2011，126: 1636-1642.

Effect of Extrusion Degreasing Process on Antioxidative Activity of Peptides Prepared by High Temperature Soybean Meal

Qi Baokun Sui Xiaonan Ma Wenjun Wang Zhongjiang Ding Jian Li Yang Jiang Lianzhou Wang Shengnan

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)

extrusion, high temperature soybean meal, peptides, antioxidative activity

TS214.2

A

1003-0174(2016)12-0051-06

國家自然科學基金(31301501)，黑龍江省教育廳自然科學基金面上項目(12531049)，黑龍江省自然基金(QC2013C014)，黑龍江博士后科研啟動金(LBH-Q13018)

2015-04-16

齊寶坤，男，1986年出生，博士，糧食油脂及植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食油脂及植物蛋白工程