BTI保護法測定小麥水解蛋白中谷氨酰胺含量

王章存 王許東 張子峰 安廣杰 曹 芹

(鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院1，鄭州 450002)(鄭州新威營養技術有限公司2，鄭州 450002)

BTI保護法測定小麥水解蛋白中谷氨酰胺含量

王章存1王許東2張子峰2安廣杰1曹 芹1

(鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院1，鄭州 450002)(鄭州新威營養技術有限公司2，鄭州 450002)

根據蛋白中谷氨酰胺與BTI試劑反應后不再被酸解轉化為谷氨酸的原理，介紹了測定蛋白質和肽中谷氨酰胺方法，主要包括樣品的BTI處理、酸解、PITC衍生和HPLC色譜分析等。以小麥水解蛋白為例，測定結果為：結合態谷氨酰胺質量分數為(26.178±0.061)%，游離谷氨酰胺質量分數為(0.121±0.008)%，其他17種游離氨基酸質量分數為(2.053±0.034)%。丙氨酰-谷氨酰胺二肽標準品和游離氨基酸含量測定結果印證了該方法是可靠的，可測定蛋白質和肽分子中的谷氨酰胺含量。

小麥水解蛋白 結合態谷氨酰胺 BTI試劑 PITC衍生

谷氨酰胺是組成蛋白質的重要氨基酸之一，也是動物體的一種條件性必需氨基酸。它可以促進動物小腸絨毛膜的生長發育，促進皮膚的快速愈合，提高機體的運動耐力等，在動物機體代謝中具有十分重要的功能[1-2]，而且大量研究表明，結合態比游離態谷氨酰胺具有更好的營養效果[3-5]，因此，近年來人們十分重視結合態谷氨酰胺的開發利用。

小麥蛋白具有豐富的谷氨酰胺，以小麥蛋白為原料通過酶解制備含有結合態Gln活性肽的研究受到國內外高度關注[6-8]，但如何有效評價蛋白質酶解產物中結合態谷氨酰胺的含量是困擾人們的主要難題。因為目前測定蛋白質及肽中氨基酸含量時首先用鹽酸水解樣品，此時蛋白質及肽中的谷氨酰胺(Gln)轉化為相應的谷氨酸(Glu)，后者也是蛋白質中的固有氨基酸。因此，分析報告中Glu的含量實際是Gln轉化所得Glu與蛋白質中固有Glu含量之和。

目前結合態Gln的測定方法主要有基因或序列分析法、酶法[9]和BTI試劑保護法[10]。基因序列法因操作周期長、難度大、費用高等原因而無法普及；酶解法因無法確保結合態Gln的完全釋放，也不能有效利用。BTI保護法是基于蛋白質中Gln(也稱作結合態Gln)與試劑 [二(三氟乙酰氧基)碘]苯, 縮寫為BTI)反應轉化為對酸穩定的L-2,4-二氨基丁酸(DABA)，因此可以通過測定BTI保護后樣品中DABA含量來計算Gln含量[10-13]。但該法需要DABA作為標準品且價格較高，而且結合態Gln與BTI的反應產物未必全部是DABA，這是影響該方法廣泛應用的制約因素。因此有必要探討新的分析方法。

本研究根據BTI衍生化反應原理，通過BTI保護和未經保護蛋白質樣品經酸水解后的Glu含量差值來計算蛋白質中的Gln含量，可省去以DABA標準品的測定。同時通過測定小麥水解蛋白中游離Gln含量，進一步確認樣品中Gln的存在狀態。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小麥水解蛋白(粗蛋白80.93%)：鄭州新威公司；Gln標準品(純度99.9%)：日本協和KYOWA KIRIN公司；Ala-Gln二肽標準品(純度為99. 34%)：上海旭新科技公司；雙-(三氟乙酰氧基)-碘苯(BTI，分析純)：阿拉丁試劑(上海)公司；Venusil AA分析方法包(包括17種標準Aa，內標物正亮氨酸，異硫氰酸苯酯，三乙胺)：天津Agela科技公司。其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀(HPLC)：Lab-Tech萊博泰科公司；Venusil AA 分析專用柱(4.6×250 mm，5 μm)：天津博納Agela公司；干式氮吹儀(DN-12A)：無錫沃信公司。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品的BTI保護處理

[11-12]的方法并做適當改進。取1.0 mL小麥水解蛋白樣品液(1%)，加1.5 mL BTI溶液(乙腈溶解)和0.25 mL吡啶水溶液，于50 ℃水浴保溫5 h以上。然后，再用氮吹儀吹干。另取1份樣品液，加入同樣的乙腈和吡啶水溶液，保溫和干燥方法不變，作為對照樣品。

1.3.2 樣品的酸水解

在BTI保護和對照樣品中分別加入10 mL 含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置-20 ℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水解液1mL，置濃縮管中濃縮儀濃縮至干(或用氮氣吹干去除鹽酸)，加入1.0 mL濃度為0.1 mol/L 稀HCl溶解，用0.45 μm濾膜過濾后，供衍生使用。

1.3.3 Aa標準溶液和樣品溶液的衍生

準確量取Aa標準溶液及樣品液200 μL ，分別置入1 mL 離心管中，往每個離心管中準確加入正亮氨酸內標溶液20 μL ，然后加入三乙胺乙腈溶液 100 μL ，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置 1 h，然后加入正己烷 400 μL ，振搖后放置10 min，取下層溶液(PTC-AA)，用0.45 μm 微濾器過濾上色譜柱。

1.3.4 Ala-Gln二肽標準品的處理

取適量Ala-Gln二肽標準品按前述BTI保護、酸解和衍生等方法處理后上柱分析。

1.3.5 HPLC色譜條件：

色譜柱：Venusil AA分析柱 4.6 mm×250 mm, 5 μm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min，測定波長：254 nm；流動相A：為0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5)∶乙腈=93∶7；流動相B為乙腈∶水=80∶20(V/V)；線性梯度洗脫程序為：0～4 min，0～3% B；4～16 min，3%～11% B；16～17 min，11%～21% B；17～32 min，21%～34% B；32～34 min，34%～100% B；38.01 min，0% B；38.01～45 min，0% B。

1.3.6 游離氨基酸總量和游離態Gln含量的測定

將一定量小麥水解蛋白樣品加入稀酸溶液充分溶脹后離心，取上清液即游離氨基酸(包括Gln)樣品溶液。另取Gln標準品，按相同方法用PITC衍生后上柱分析。

1.3.7 試驗結果的處理

按Aa常規分析方法，分別計算BTI保護和未保護樣品中的Glu含量、游離氨基酸總含量。試驗數據用SPSS 11.0 軟件統計，結果以平均數±標準差表示。Glu和Gln的分子質量分別為147.1和146.2，所以Gln對Glu的質量換算系數為0.994。

2 結果與討論

2.1 樣品氨基酸圖譜

小麥水解蛋白樣品按常規氨基酸分析方法測定(即未經BTI保護)結果如圖1所示。其中正亮氨酸是內標物。Venusil AA 色譜柱和選擇的洗脫條件可以很好地分離各種氨基酸。以標準氨基酸測定結果進行校正和計算該樣品中各種氨基酸含量，3次重復試驗氨基酸質量分數為 (79.587±0.119) % 。其中3次試驗Glu質量分數分析值分別為28.952%、29.016%、28.779%，統計結果為(28.916±0.123) %。可見，該分析結果重復性很好。

圖1 樣品Aa圖譜

2.2 BTI保護樣品氨基酸圖譜

圖2是小麥水解蛋白經BTI保護后酸水解產物的氨基酸圖譜。與未經保護的蛋白質樣品(圖1)相比，該圖譜中Glu峰很小，氨基(NH3)峰也很小，表明BTI對Gln有很好的保護效果，可以抵抗酸水解而不再生成Glu，在Phe和Lys峰之間新增加一個高峰，經以BTI保護的Ala-Gln二肽標準品的圖譜(圖3)指認，該峰即是DABA峰。

圖2 BTI保護樣品Aa圖譜

經BTI保護樣品Glu質量分數3次測定值分別為2.581%、2.643%和2.513%，統計結果為平均值(2.579±0.062)%，重復性較好。

根據測定原理，BTI保護和未保護樣品中的Glu含量差值為(26.336±0.061)%，即為樣品中結合態Gln水解所得。根據1.3.7，可計算出小麥水解蛋白中結合態Gln質量分數為(26.178±0.061) %。說明在該小麥水解蛋白樣品中，結合態Gln占Glu和Gln總和的91.03% ，這意味在常規方法測定的Glu結果中，絕大部分是由Gln貢獻的。

圖3 Ala-Gln二肽標準品經BTI保護分析圖譜

2.3 游離Aa(Aa)總量和游離Gln含量

對小麥水解蛋白中游離氨基酸的分離結果如圖4所示。各種氨基酸含量與原料蛋白中相應氨基酸有差異，并不是等比例釋放氨基酸(這與酶的水解位點有很大關系)。通過標準氨基酸峰面積校正計算，17種游離氨基酸含量只有(2.053±0.034)%，另外，根據標準品Gln峰面積(圖5)校正計算，樣品中游離Gln含量為(0.121±0.008) %，說明該樣品中絕大部分氨基酸(97.3%)以肽的形式存在。

圖4 小麥水解蛋白樣品游離氨基酸分離圖譜

圖5 標準Gln分離圖譜

3 結論

小肽分子中結合態Gln在動物營養代謝和應激反應中具有特殊生理功能。因此，蛋白質酶解產物中結合態Gln的含量測定對于評價蛋白質的酶解效果十分重要。但目前氨基酸分析方法均采用酸水解法，無法測定結合態Gln和Asn。本研究以小麥水解蛋白為例，根據蛋白質中的Gln與BTI試劑反應轉化為其他化合物后不再受酸水解影響的原理，通過常規氨基酸分析中谷氨酸含量與樣品經BTI反應后谷氨酸含量的差值計算結合態Gln含量，并以Ala-Gln二肽標準品和游離氨基酸測定對結果進行了印證，證明該方法是可靠的。與目前所用DABA標準品法相比，本方法具有明顯的優勢和更廣泛的實用價值。

參考文獻

[1]劉濤. 谷氨酰胺對早期斷奶仔豬腸道營養與免疫功能影響機理的研究[D].武漢：華中農業大學,2002

[2]Julia B E, Gordon K M, Johnson I R, et al. Glutamine supplementation improves intestinal barrier function in a weaned piglet model of Escherichia coli infection[J]. British Journal of Nutrition, 2011, 106, 870-877

[3]桑劍鋒,吳文溪. 丙氨酰谷氨酰胺二肽的代謝及在腸外營養中的應用[J]. 腸外與腸內營養, 2001,8(1): 46-50

[4]任國譜,李玉英,谷文英. Gln活性肽營養液的穩定性及其營養作用的研究[J].中國糧油學報, 2003,18(3)：35-39

[5]Luo M, Bazargan N, Griffith D P, et al. Metabolic effects of enteral versus parenteral alanyl-glutamine dipeptide administration in critically ill patients receiving enteral feeding: a pilot study[J]. Clinical Nutrition, 2008, 27(2): 297-306

[6]Swails W S, Bell S J, Borlase B C, et al. Glutamine Content of Whole Proteins: Implications for Enteral Formulas[J]. Nutrition in Clinical Practice,1992, 7:77-80

[7]Merrill D A，Hunter E A. Method for producing a gluten-free peptide preparation and preparation thus obtained[P]. US Patent 6692933-2004

[8]劉文豪. 麥谷蛋白源谷氨酰胺肽的制備和腸道營養效果研究[D]. 武漢：華中農業大學,2008

[9]Tsao M，Otter D E. Quantification of glutamine in proteins and peptides using enzymatic hydrolysis and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry, 1999, 269(1):143-148

[10]Kuhn K S, Peter S，Peter F. Quantitative analyses of glutamine in peptides and proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(7):1808-1811

[11]陶冠軍,任國譜,谷文英. 蛋白質和肽中谷氨酰胺的HPLC定量分析[J]. 鄭州糧食學院學報,1999,20(4): 65-67

[12]張海華,陶冠軍,周惠明. UPLC快速測定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量[J]. 食品工業科技, 2012,33(1): 338-339.

Determination of Bound-Glutamine in Hydrolyzed Wheat Protein with BTI Reagent

Wang Zhangcun1Wang Xudong2Zhang Zifeng2An Guangjie1Cao Qin1

(School of Food & Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry1, Zhengzhou 450000)Zhengzhou Newwill Nutritional Technology Co., Ltd2.,Zhengzhou 450000)

A simple yet accurate method for the analysis of glutamine content in polypeptides was described, which includes reaction between BTI reagent and peptide bound glutamine, acid hydrolysis, PITC derivation and HPLC analysis. The results of wheat protein hydrolyzed showed that bound glutamine was (26.178±0.061)%, free glutamine was (0.121±0.008)%, the total of other 17 free amino acid was (2.053±0.034)%. The results of standard alanyl-glutamine dipeptide and free amino acids measurement manifested the reliability and accuracy of the method.

hydrolyzed wheat protein, bound glutamine, BTI reagent, PITC derivation

TS207.3

A

1003-0174(2016)06-0150-04

國家自然科學基金(31071517)

2014-10-10

王章存，男，1963年出生，教授，糧油蛋白質深加工