油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究

劉 普 李小方 牛亞琪 鄧瑞雪 董俊青 尹衛平

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術研究中心 河南科技大學化工與制藥學院，洛陽 471023)

油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究

劉 普 李小方 牛亞琪 鄧瑞雪 董俊青 尹衛平

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術研究中心 河南科技大學化工與制藥學院，洛陽 471023)

以低聚茋類化合物提取率為評價指標，在單因素研究的基礎上，利用響應面分析法優化油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的提取條件，并對提取物的抗菌、抗氧化及抑制腫瘤細胞活性進行測試。結果表明油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數為70%，液料比為40∶1 mL/g，水浴溫度70 ℃，超聲時間40 min，在此條件下低聚茋類總提取率達到6.39%。活性測試顯示油用牡丹中低聚茋類化合物具有較好的抗菌、抗氧化和抑制腫瘤細胞的活性。

油用牡丹 低聚茋類化合物 響應面法 生物活性

牡丹為芍藥科落葉灌木，是原產中國著名的觀賞花卉。牡丹全身是寶，其根皮、花、葉、種子等均可被應用。2011年3月，國家衛生部批準由丹鳳(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(P.rockii)的種子經壓榨法制備的牡丹籽油可以作為新資源食品應用(中華人民共和國衛生部2011年第9號公告)。牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸[1]，具有非常重要的保健及藥用價值。研究表明，不脫殼油用牡丹籽榨油后的籽餅粕中含有較多的低聚茋類化合物[2]。

低聚茋類化合物是一類具有1, 2-二苯乙烯骨架的聚合物的總稱，主要由白藜蘆醇及其衍生物以同種或異種單體經脫氫后形成的聚合度不等的天然產物。近年來，低聚茋類化合物由于具有復雜的結構和良好的生物活性[3-6]，而備受研究者的關注[7]。

目前鮮見油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究的報道。本研究通過響應面分析法優化油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的提取工藝，并通過抗菌、抗氧化和抑制腫瘤細胞作用來探討提取物的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油用牡丹籽餅粕由洛陽全福食品有限公司提供，為不脫殼紫斑牡丹(P.rockii)種子用壓榨法榨油后剩余部分。原植物由河南科技大學侯小改教授鑒定，種子標本(FNS201301)存放于河南科技大學伏牛山天然產物資源標本館。

牡丹醇A (Suffruticosol A)：自制，純度>98%(HPLC)；鉬酸鈉：天津市化學試劑四廠；鎢酸鈉，無水碳酸鈉，溴素，磷酸，磷鉬酸：天津市大茂化學試劑廠；磷酸，濃鹽酸，硫酸鋰：天津市博迪化工有限公司；沒食子酸，2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：阿拉丁試劑；PBS磷酸鹽緩沖劑，MTT(噻唑蘭)，FBS特級胎牛血清，DMEM高糖型培養基，1640培養基：北京索萊寶科技有限公司；超純水：自制。

人肝癌HepG2和Hep3B細胞株由河南科技大學醫學院提供。金黃色葡萄球菌(S.aureas)，白葡萄球菌(S.cremoris)、乳房鏈球菌(S.uberis)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，大腸桿菌(E.agalactiae)，綠膿假單胞菌(P.pyocyaneum)等由河南科技大學第一附屬醫院提供。

1.2 儀器與設備

Ymnl-2008DE智能溫控雙頻超聲波萃取儀：南京以馬內利儀器設備有限公司；UV 2501-PC紫外-可見分光光度計：島津公司；RE-2000A旋轉蒸發器，SHZ-D(Ⅲ) 型循環水真空泵：河南省予華儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；HANGPING FA2004電子天平：上海越平科學儀器有限公司；H-1650臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BPN-50CH二氧化碳培養箱：上海一恒科技儀器有限公司；MR5000酶標儀：上海天美生化儀器工程有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚茋類化合物的提取

稱取1.0 g牡丹籽餅粕粉末，加入一定體積分數的乙醇，控制系統的溫度，在超聲提取器中提取一定時間。將提取液離心，取上清液，60 ℃條件下減壓蒸發除去乙醇，殘余物用50%乙醇溶解，過濾，定容于100 mL容量瓶中，即為低聚茋類化合物提取液，4 ℃避光保存。

1.3.2 低聚茋類化合物含量測定

采用Folin-Ciocalteu試劑法[8-9]來測定低聚茋類提取物的含量。以沒食子酸為標準品進行標準曲線繪制，檢測波長為750 nm。所得到回歸方程為：Y=0.094 3X+0.047 (R2=0.999 6)。

分別取提取物溶液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入60 mL的水，混合后加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將溶液在20 ℃放置30 min后，在波長為750 nm下測定吸光值，由標準曲線計算出低聚茋類提取物相當于沒食子酸的量。

1.3.3 抗菌活性篩選

1.3.3.1 菌懸液的制備

取少量已活化的待測菌于裝有9 mL無菌水的試管中，充分混合，制成菌懸液，用無菌吸管取1 mL菌懸液于試管中，加無菌水9 mL，依次制成濃度106～107個/mL的菌懸液，備用[10]。

1.3.3.2 瓊脂打洞擴散法

將上述菌株混懸液，分別涂布于厚約6 mm 的藥皿平板上，然后在其中打成直徑約6 mm 的孔，加入質量濃度為7.5 μg/mL的樣品溶液，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈大小。

1.3.3.3 瓊脂擴散法

取低聚茋類提取物用甲醇稀釋，采用二倍稀釋法將質量濃度配制為7.5、3.75、1.88、0.938、0.469、0.234、0.117 μg/mL。然后在血平板上點種上述菌株。37 ℃培養24 h，測試茋類提取物的抑制菌株生長的最低藥物濃度MIC。

1.3.4 抗氧化活性篩選

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測定[11]

將低聚茋類提取物用乙醇稀釋成不同質量濃度的溶液，各取2 mL于容量瓶中，分別加入濃度為0.04 mg/mL的DPPH 溶液2 mL，振搖均勻，室溫下反應20 min，離心，吸取上清液置于比色皿中，在517 nm波長下測定吸光度(A1)；另外，再各取2 mL不同濃度的低聚茋類化合物溶液置于容量瓶中，分別加入無水乙醇 2 mL，按照上述方法處理后，同樣在波長517 nm處測定吸光度(A2)；以2 mL 0.04mg/mL的DPPH和2 mL無水乙醇反應做為參比，其吸光度記為A0。則E(DPPH)為低聚茋類提取液對DPPH自由基的清除率。

E(DPPH)=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3.4.2 ABTS自由基清除能力測定[12]

將ABTS用蒸餾水配制成2 mmol/L 溶液，取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8水溶液(70mmol/L) 混合均勻，避光放置12～16 h，得ABTS·+溶液。用磷酸鹽緩沖液將ABTS·+溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02。將牡丹籽餅粕低聚茋類提取物不同體積分數乙醇洗脫物用95%乙醇配制質量濃度為10 mg/mL的樣品液，取0.1 mL不同乙醇體積分數的洗脫樣品，加入1.9 mL ABTS·+溶液，混勻，在735 nm波長下測定其吸光度。

ABTS·+自由基清除率的計算公式：

S= (A0-A)/A0×100%

式中：A0為ABTS·+溶液的吸光度，A為加樣品后的吸光度。

1.3.4.3 超氧陰離子清除率測定

用NADH-PMS-NBT法[13]測定：采用Tris-HCl 緩沖液(濃度0.05 mmol/L，pH 8.0)將低聚茋類提取物溶液稀釋成不同的質量濃度，分別取1.5 mL溶液置于5 mL容量瓶中，然后依次加入0.5 mL 300 μmol/L的NBT，0.5 mL 468 μmol/L的NADH，0.5 mL 60 μmol/L 的PMS，充分混勻之后，放入25 ℃水中5 min，然后在560 nm下測定吸光度，以緩沖液來代替低聚茋類溶液作為空白對照。

E(超氧陰離子)=(1-A0/A1)×100%

式中：E(超氧陰離子)為牡丹籽餅粕低聚茋類提取液對超氧陰離子的清除率/%；A1為牡丹籽餅粕低聚茋類提取液的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

1.3.4.4 總的抗氧化活性能力測定方法[11,14]

取不同質量濃度的樣品溶液1.0 mL，分別置于10 mL離心管中，加入3.0 mL試劑溶液(包括0.6 mol/L的硫酸、28 mmol/L的磷酸鈉、4 mmol/L的鉬酸銨)。混合液于95 ℃水浴鍋中水浴90 min。冷卻至室溫，在695 nm處測吸光度。以蒸餾水為空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越強。

1.3.4.5 亞鐵離子還原(FRAP)能力測定方法[11,14]

FeSO4標準曲線的繪制：準確稱取6.08 mg硫酸亞鐵，溶于適量的水中，加入18 mol/L的硫酸0.25 mL, 再加水定容至50 mL，并放入小鐵釘。取上述溶液5 mL，加水定容至50 mL，即為800 μmol/L FeSO4標準溶液。用該溶液配制梯度FeSO4溶液，包括400、200、100、50、25 μmol/L，于593 nm測定吸光值，繪制標準曲線。

分別取不同質量濃度的各樣品溶液0.3 mL，加2.7 mL預熱至37 ℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm測其吸光度值，以無水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白，每個質量濃度做3次，求平均值。根據所得吸光值，在標準曲線上求得相應FeSO4濃度，定義為FRAP值，其值越大，抗氧化活性越強。

1.3.5 抑制腫瘤細胞活性測試

1.3.5.1 細胞株懸浮液制備

將腫瘤細胞株培養在培養液(含FBS胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100單位/mL及0.03%谷氨酰胺)中，待細胞進入對數生長期后，將生長較好的細胞放入離心管離心，棄上清液。往離心管中加入PBS，用移液管反復吹吸，使所有的細胞都處于懸浮狀態。

1.3.5.2 MTT法檢測細胞增殖

將細胞株懸液接種于96孔培養板，每孔2.5×104個細胞，100 μL，每個濃度設3個副孔，置于細胞培養箱中培養。待大部分細胞貼壁，將培養板取出，加藥，培養24 h，每孔加MTT 20 μL(5 mg/mL)，繼續培養。然后小心吸出孔中所有的液體，然后每孔加入100 μL異丙醇，繼續培養15 min，然后將培養板放入酶標儀中，在570 nm波長測定各組吸光度(A)值。

按照公式計算細胞增殖抑制率：

抑制率=[(對照組A值-試驗組A值)/對照組A值]×100%

2 結果與討論

2.1 沒食子酸標準曲線繪制

對照品標準曲線如圖1所示，曲線的回歸方程為：Y=0.094 3X+0.004 7，R2= 0.999 6，式中：X為樣品質量濃度(μg/mL)；Y為吸光度值。方程表明，標準品質量濃度在0.5～0.35 μg/mL的范圍內呈線性關系。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液料比的影響

固定乙醇體積分數為70%，提取時間20 min，提取溫度40 ℃，在液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g的條件下研究液料比對提取率的影響。

由圖2 可得出，提取率在3.54%～3.86%之間變化，隨著提取液用量的增加，提取率在不斷增加。當液料比達到30∶1 mL/g時，達到3.86%，再增加提取劑用量時，提取率變化不顯著。為節省溶劑同時兼顧茋類提取率，液料比選擇30∶1 mL/g較優。

圖2 茋類提取物提取率隨液料比變化曲線

2.2.2 乙醇濃度的影響

固定液料比30∶1 mL/g，提取時間20 min，提取溫度40 ℃，分別以20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液作提取劑來考察提取率的影響。

圖3 茋類提取物提取率隨乙醇濃度變化曲線

由圖3可以得知，隨著乙醇濃度的增大，提取率在1.60%～4.35%之間變化。當達到70%乙醇時，提取率達到最大值4.35%。隨后再增加乙醇濃度，反而下降。因此牡丹籽餅提取茋類化合物時，選用70%乙醇為宜。

2.2.3 提取時間的影響

固定液料比30∶1 mL/g，70%乙醇，提取溫度40 ℃，研究超聲提取時間分別為15、20、25、30、35、40 min時對提取率的影響。

圖4 茋類提取物提取率隨超聲時間的變化曲線

從圖4可以看出，牡丹籽餅中茋類提取物的提取率隨著超聲時間的延長而增大，其變化范圍在5.512%～5.853%之間。在提取時間為30 min時，提取率的增加開始變得緩慢。所以牡丹籽餅提取茋類，超聲提取時間選擇為40 min較優。

2.2.4 提取溫度的影響

固定液料比分別為30∶1 mL/g，溶劑70%乙醇，超聲提取時間40 min，研究提取溫度分別為35、45、55、65、75 ℃時對提取率的影響。

圖5 茋類提取物提取率隨提取溫度的變化曲線

由圖5可知，在35～55 ℃之間，提取率隨著超聲提取溫度的增加而明顯增加，在65 ℃時達到最大值6.218%，繼續升高溫度，提取率開始下降。此時提取牡丹籽餅中的茋類化合物應選擇溫度為65 ℃。

由單因素試驗可知，最優提取條件為：液料比30∶1 mL/g，70%乙醇，超聲提取40 min，提取溫度65 ℃。

2.3 響應面分析優化工藝條件

2.3.1 響應面分析的設計及結果

在單因素試驗結果基礎上，選取液料比、乙醇體積分數、超聲時間、水浴溫度對牡丹籽餅茋類提取率影響較大的因素，根Box-Beknhen[13]中心組合試驗設計原理[14]，設計4因素3水平的響應面試驗。總共進行29次試驗，每個試驗點重復3次，結果取3次數據的平均值。試驗因素及水平如表1所示。

表1 牡丹籽餅茋類提取響應面試驗因素和水平表

表2 響應面試驗分析及結果

綜合單因素試驗，選擇對茋類提取率影響顯著的液料比、乙醇體積分數、超聲時間、水浴溫度，通過響應面分析方法，響應面分析試驗所得結果如表3所示。利用統計軟件Design Expert 8對所得數據進行分析，進行回歸擬合，得茋類化合物提取率方程為：

R=5.13+1.44×A+0.36×B+0.26×C+0.41×D+0.096×A×B-5.795E-003×A×C-0.12×A×D-0.26×B×C-0.13×B×D+0.15×C×D-1.05×A2+0.23×B2-0.012×C2-0.24×D2

表3 響應面試驗方差分析結果

模型的可靠性可從方差分析及相關系數來考察。由表3知，通過方差分析，可以看出A(乙醇體積分數)，B(液料比)，C(超聲時間)，3個因素對茋類提取率影響顯著，因素影響順序為液料比>乙醇體積分數>超聲時間。模型P<0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平，說明該方程與實際情況擬合很好，能夠正確地反映茋類提取率與乙醇體積分數、液料比和超聲時間之間的關系。失擬項P=0.079 011>0.05，不顯著，說明本試驗無其他因素的顯著影響，模型是合適的。

2.3.2 優化與驗證試驗

利用Design-Expert 7.0軟件從模型中得到低聚茋類的理論最佳提取工藝的條件：70.55%乙醇，液料比為40∶1 mL/g，提取時間40 min，提取溫度70.08 ℃。此時提取率為6.39%。為驗證響應面的可行性，采用所得到的優化后的提取條件對茋類提取率進行驗證試驗，所采用的實際操作條件為70%乙醇，液料比為40∶1 mL/g，提取時間40 min，提取溫度70 ℃，并據此進行結果驗證。平行測定3次獲平均提取率為6.39%，與理論值基本吻合。說明采用響應面法優化得到的超聲提取條件參數準確可靠，具有一定的實用價值。

2.4 抗菌活性研究

測定樣品質量濃度為7.5 mg/mL抑菌圈大小，并將樣品稀釋，測定樣品最低抑菌質量濃度。

表4 對供試菌的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(IC50)

由表4可以看出，提取物對上述幾種菌株均顯示出非常好的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.118mg/mL，最大抑菌濃度為0.469 mg/mL，尤其是對致病菌—耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，具有較好的研究開發前景。

2.5 抗氧化測試結果

2.5.1 對DPPH自由基的清除作用

如圖6所示，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對DPPH的清除能力較強，呈現一定的量效關系，其半數抑制濃度(IC50)約為40.52 μg/mL，在低濃度時，其清除DPPH能力大于VC，但是當濃度大于55.2 μg/mL，清除能力小于VC。

圖6 提取物對DPPH自由基的清除作用

2.5.2 對ABTS自由基的清除作用

油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對DPPH的清除能力隨其質量濃度的增大而增強(圖7)，呈現一定的量效關系，其IC50約為38.65 μg/mL，在相同質量濃度時，其清除DPPH能力均大于VC，在質量濃度為50 μg/mL時，其清除率為VC的1.3倍。

圖7 提取物對ABTS自由基的清除作用

2.5.3 對超氧陰離子的清除作用

從圖8可看出，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對超氧陰離子的清除能力隨其質量濃度的增大而增強，呈現一定的量效關系，在相同濃度時，其清除DPPH能力均大于VC，低聚茋類提取物IC50約為34.68 μg/mL，小于VC的IC50值46.54 μg/mL。

圖8 提取物對超氧陰離子的清除作用

2.5.4 對羥自由基的清除作用

如圖9所示，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對羥自由基的清除能力隨其質量濃度的增大而增強，在相同濃度時，其清除DPPH能力均略小于VC，低聚茋類提取物IC50約為26.45 μg/mL，與VC的IC50值24.58 μg/mL相當。

圖9 提取物對羥自由基的清除作用

2.5.5 總的抗氧化活性能力測定方法

低聚茋類提取物總抗氧化能力隨其質量濃度的增大而增強(圖10)，呈現一定的量效關系，在相同濃度時，其抗氧化能力均大于VC。

圖10 提取物總抗氧化能力

2.5.6 亞鐵離子還原(FRAP)能力測定方法

油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對亞鐵離子還原能力(圖12)隨其質量濃度的增大而增強，呈現一定的量效關系，在相同濃度時，其還原能力均略小于VC。在質量濃度為30 μg/mL時，低聚茋類提取物的FRAP值為467.8，而VC的則為487.6，相差比較少。

圖11 硫酸亞鐵標準曲線

圖12 提取物亞鐵離子還原能力

2.6 抑制腫瘤細胞測試結果

從圖13和圖14可以看出，MTT法檢測出牡丹籽餅粕中茋類提取物對人肝癌細胞HepG2和Hep3B增殖具有一定抑制作用，其抑制作用隨質量濃度的增大而增強，呈現出一定的劑量上的依賴性。對肝癌細胞HepG2的抑制作用稍大于對肝癌細胞Hep3B的抑制作用。

圖13 低聚茋類化合物對肝癌細胞HepG2的抑制作用

圖14 低聚茋類化合物對肝癌細胞Hep3B的抑制作用

3 結論

3.1 由掃描波長可以看出，低聚茋類提取物與沒食子酸、牡丹醇A具有相同的紫外吸收波長，因此，可以采用沒食子酸來測定低聚茋類化合物的含量。

3.2 油用牡丹籽餅粕中含有豐富的低聚茋類化合物[2]。采用響應面分析法優化超聲提取低聚茋類化合物的條件為：乙醇體積分數為70%，液料比為40∶1 mL/g，提取時間40 min，提取溫度70 ℃。此時提取率為6.39%。

3.3 油用牡丹籽餅粕中低聚茋類提取物具有一定的抗氧化，抗菌和抑制腫瘤細胞活性。隨著牡丹籽油的應用，油用牡丹的種植面積在逐年擴大，副產物牡丹籽餅粕也會越來越多，因此，有必要對油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物展開純化工藝及活性的深入研究。

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Optimization Extraction Technology of Oligostilbenes from Seed Cake of Peony for Oil and Its Bioactivities

Liu Pu Li Xiaofang Niu Yaqi Deng Ruixue Dong Junqing Yin Weiping

(Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source,Chemical Engineering & pharmaceutical College,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023)

Stilbene compounds extraction yield as the evaluation index and on the basis of single-factor study, using the response surface analysis to optimize extraction condition of low poly stilbene compounds in the oil with peony seed cake. Meanwhile, the antioxidant, antimicrobial and antitumor activities of total oligostilbenes extract were assessed. The optimal values of the variables were as follows: ultrasonic treatment time 40 min, extraction temperature 70 ℃, ethanol concentration in aqueous solution 70%, and liquid/solid ratio 40∶1 (mL/g). Under such conditions, the predicted value of extraction yield of total oligostilbenes extract was 6.39%. The results of the bioactivities assay showed that the extraction of total oligostilbenes displayed varying degrees of antibacterial activity, exhibited strong activities against human HepG2and Hep3B in antitumoral activity, and also had strong antioxidant capacity.

peony for oil, oligostilbenes, response surface methodology, bioactivities

TS229

A

1003-0174(2016)06-0079-08

河南省科技項目(152102110079，162102310202)，河南省高校項目(16A210019)

2014-08-24

劉普，男，1978年出生，副教授，牡丹深加工的研究與開發

鄧瑞雪，女，1978年出生，副教授，功能活性天然產物