對亞硝酸鹽含量檢測的確定與方法驗證

■文/馬曉君

對亞硝酸鹽含量檢測的確定與方法驗證

■文/馬曉君

亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、水、蔬菜及腌制的動物性食品中,也是廣泛存在于自然環境中的化學物質。自然界中的很多食物，包括糧食、蔬菜、魚類、蛋類、肉類中都含有亞硝酸鹽。蔬菜是人們日常生活中攝入量最多的，也是一種易于富集硝酸鹽的植物性作物。

據國際糧農組織1990年統計，人體所需的90%維生素C、60%維生素A均來自蔬菜，蔬菜提供人體所需維生素的同時，也提供了進入人體80%～90%的硝酸鹽。現代醫學證明，雖然硝酸鹽對人體沒有直接毒害作用，但過量的硝酸鹽進入人體后，在一些酶和微生物作用下可轉變為有毒的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽是強氧化劑，進入血液與血紅蛋白結合，使氧合血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力,導致組織缺氧，而出現一系列缺氧的中毒病癥，嚴重時可使人死亡。另外，亞硝酸鹽對血管有擴張作用，它還可與胃中的次級胺結合形成致癌物質亞硝酸胺，引起消化系統癌變；亞硝酸鹽也可以通過胎盤進入胎兒體內，引起胎兒畸變。因此,硝酸鹽和亞硝酸鹽含量是評價蔬菜品質的重要指標之一。

選擇以黃瓜為例的瓜類、以白菜為例的綠葉類、以茄子為例的茄果類蔬菜作為試材。

亞硝酸鹽含量測定

一、溶液配制（G B5009.33-2010）

1、飽和硼砂溶液（50g/L）：稱取5.0g硼酸鈉(Na2B07?10H2O)，溶于100mL熱水中，冷卻后備用。

2、亞鐵氰化鉀溶液（106g/ L）：稱取1 0 6.0 g亞鐵氰化鉀[K4Fe9(CN)5?3H2O]，用水溶解，并稀釋至1000mL。

3、乙酸鋅溶液（220g/L）：稱220g乙酸鋅[Zn(CH2C00)2?2H2O]，先加30mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1000mL。

4、對氨基苯磺酸溶液（4g/ L）：稱0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL20%（V/V）鹽酸中，混勻后，至棕色瓶中，避光保存。

5、N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽溶液(2g/L):稱取0.2gN-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽，溶入少量水中后全部轉移至100mL容量瓶中，加水至標線，混勻。置于棕色瓶避光保存。

6、亞硝酸鈉標準溶液（100g/ L）:準確稱取0.1000g于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加水移入1000mL容量瓶，加水稀釋至刻度，混勻。

7、亞硝酸鈉標準溶液（10g/ L）：臨用前，吸取10mL亞硝酸鹽標準溶液，置于100mL容量瓶，加水稀釋至刻度。

所用試劑未注明均為分析純，實驗用水均為去離子水。所有實驗用的玻璃儀器均用去離子水冼滌使其徹底干凈，以確保無外來硝酸根離子(NO3

-)和亞硝酸根離子(NO2-)的干擾。

二、標準曲線

采用國家標準（GB5009.33-2010）鹽酸萘乙二胺法。配制一系列各濃度的亞硝酸鹽溶液：取10ug/ mL亞硝酸鈉標準使用液0.00mL、0.10m L、0.20m L、0.40m L、0.60m L、0.80m L、1.60m L、2.00mL，分別置于50mL帶塞比色管中。于標準管中分別加入2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3-5min，加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色皿，以零管調節零點，于波長538nm處測吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制亞硝酸鹽的標準曲線。

根據標準曲線，采用下式計算亞硝酸鹽含量，亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）：

X1——樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；

M——樣品質量（g）；

A1——測定用樣液中亞硝酸鹽的質量（μg）；

V0——樣品處理液總體積（mL）；

V1——測定取樣液體積（mL）。

三、回收率的測定

參考馬巍（1999）[8]方法，采用加外標回收率的方式驗證樣品消解損失程度和方法的準確度。

四、精密度測定

配制10ug/mL亞硝酸鹽標準溶液，移取0.8mL的該標準溶液于50mL比色管內，按照重氮化偶合法在538nm處重復測定標樣7次，計算吸光度的平均值和標準平均偏差。

五、數據處理

對試驗試數據采用Excel及SPSS 13.0統計軟件處理。

結果與分析

一、標準曲線制作

圖1 亞硝酸鹽標準曲線

由標準曲線（見圖1）可知，標準工作曲線線性良好，不同濃度的亞硝酸鹽在538nm處的吸光度是呈線性規律，其回歸方程為y=0.6489x+0.0023，線性相關系數R=0.9997，相對系數在0.9995以上。

二、樣品前處理條件確定

1、提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響

不同提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽的影響檢測結果見圖2。

圖2 不同提取溫度和水浴時間對亞硝酸鹽的影響

由圖2可以看出，不同溫度下溶液對亞硝酸鹽的溶解量及提取速度存在差異，100℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高；70℃時，水浴時間45min提取的亞硝酸鹽含量最高，但兩種溫度相比70℃水浴下提取的亞硝酸鹽含量更為高，因此提取亞硝酸鹽的最佳水浴條件是70℃的水浴45min。

2、不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響

不同顯色時間對亞硝酸鹽檢測結果的影響測定結果（見圖3）顯色15min時，亞硝酸鹽含量檢出率最高，之后隨著顯色時間的延長，亞硝酸鹽的吸光度變小，35min后雖稍有上升，但幅度不大。亞硝酸鹽和顯色劑反應可生成絡合物，顯色15min時，其吸光度最大。故宜選擇15min作為顯色時間。

3、活性炭對亞硝酸鹽測定結果的影響

圖3 不同顯色時間對亞硝酸鹽含量測定結果的影響

活性炭對亞硝酸鹽含量的測定結果（見圖4）可以看出，加入活性血酸對亞硝酸鹽測定的干擾，使得亞硝酸鹽檢出值更為準確。因此，宜炭的試驗組樣品中亞硝酸鹽檢出值為3.50mg/kg，無活性炭的試驗組樣品亞硝酸鹽檢出值為1.00mg/kg，二者差異極顯著。活性炭可消除抗壞選擇加入活性炭處理，以提高檢出率。

圖4 活性炭對檢測結果的影響

三、方法驗證

樣品亞硝酸鹽回收率試驗測定結果（見表1）表明，3個樣品的亞硝酸鹽回收率分別為91.11%、91.00%、102.00%，平均回收率為94.63%，相對平均偏差為5.1%。檢出限數值越低，儀器和方法的靈敏度越高；內標回收率越高，儀器的準確度和精密度越高；外標回收率越高，消解損失程度越低，方法準確度越高。在運用分光光度法對樣品進行測定時，通常需要測出所用方法的待測元素的回收率，以此評價方法的準確度和可靠性，回收率越接近1，則方法的可靠性越高。

由精密度試驗測定結果（見表2）可見，通過重復測定標樣七次和計算吸光度的重復性，亞硝酸鹽的相對標準偏差為0.29%，小于2%，表明完全可滿足試驗精密度要求。

采用國標（G B 5 0 0 9.3 3-2010）鹽酸萘乙二胺法測定蔬菜中亞硝酸鹽，樣品前處理的最佳條件是在70℃水浴45min，顯色15min，加入活性炭進行消除抗壞血酸處理，平均回收率可達到94.63%，亞硝酸鹽的相對標準偏差為0.29%，相對平均偏差為5.1%。

（作者單位：甘肅省產品質量監督檢驗中心）

表1 回收率試驗測定結果

表2 精密度試驗測定結果