長白山有機靈芝提取物的遺傳毒理學實驗

林花，金龍哲，車成來，王霞，王宇輝

(延邊州農業科學院，吉林延吉133001)

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長白山有機靈芝提取物的遺傳毒理學實驗

林花，金龍哲*，車成來，王霞，王宇輝

(延邊州農業科學院，吉林延吉133001)

用小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗和Ames試驗進行了長白山有機靈芝提取物的遺傳毒性研究。對受試物的遺傳毒性及是否具有潛在致癌性進行篩選，檢測樣品的誘變性，從而評價其致突變作用的可能性。結果表明，3項試驗結果均為陰性。

長白山；有機靈芝提取物；遺傳毒性

靈芝(Ganodermalucidum)為擔子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyparales)靈芝屬(Ganoderma)大型食藥用真菌，其主要功效成份為多糖類與三萜類化合物。現代科學檢測表明，靈芝在免疫系統的調節、通過增強宿主免疫調節功能達到抗腫瘤作用[1]、抗病毒作用、通過提高氧化酶活性而清除體內自由基達到抗衰老的作用[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、護肝等方面有著極其重要的保健醫學作用。目前，國內外對以靈芝為原料的功能性食品的開發主要集中在一般人工栽培的靈芝上。近年來，隨著人們對有機食品的關注，以按國際有機動植物及菌物生產規范生產的產品為原料加工生產的有機食品已成為國際市場上的一枝新秀。本研究依據《食品安全性毒理學評價程序和方法》[5]，以有機靈芝提取物為試驗材料進行了實驗小鼠的遺傳毒理學安全性研究。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 樣品。長白山有機靈芝提取物，褐色粉末，由延邊州農業科學院農特產品加工研究所提取。以蒸餾水配制所需各劑量。

1.1.2 實驗動物。ICR小白鼠50只，雌雄各半，體重：27.0～30.5g,由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供。動物合格證號：SCXK-(吉)2003-0001。飼養溫度20～22℃，相對濕度55%～65%。

1.1.3 主要儀器。上海產電子天平(d=0.1g)，日本產顯微鏡，高速低溫離心機，超低溫冰柜，蒸汽壓力鍋，勻漿器，恒溫培養箱，恒溫水浴箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗[6]

按體重要求選用雌、雄小鼠各25只，稱重、標號、隨機分為5個劑量組，每組10只，雌、雄各半。設10.0、5.0、2.5g/kg·bw 3個受試物劑量組及陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(CP40g/kg·bw)。

對小鼠采用經口灌胃方式給予受試物，間隔4h進行2次灌胃，各劑量組每次灌胃容量均為0.2mL/10g·bw。

于2次灌胃后6h，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨以小牛血清稀釋涂片，甲醛固定，Giemsa染色。在光學顯微鏡下，每只動物計數1000個嗜多染紅細胞(PCE)，微核發生率以含微核的PCE千分率計(每只動物計數200個PCE，計算PCE/RBC比值)，并進行統計分析。

1.2.2 小鼠精子畸形實驗[7]

按體重要求選用雄性小鼠40只，稱重、標號、隨機分為5個劑量組，每組8只。設10.0、5.0、2.5g/kg·bw 3個受試物劑量組及陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(CP40g/kg·bw)。

各試驗組每日灌胃1次，連續5天，各劑量組每次灌胃容量均為0.2mL/10g·bw。

末次灌胃后第30天處死小鼠，取附睪制片，伊紅染色，每組計數5只動物，每只動物計數1000個結構完整的精子，計算畸變精子發生率，并進行統計分析。

1.2.3 Ames試驗

采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。(由哈爾濱醫科大學公共衛生學院提供)，生物學形狀符合菌株要求。測試菌液濃度每毫升不少于1×109～2×109活菌數。

采用多氯聯苯(PCB)誘導的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統。S-9制成后，經無菌檢查，測定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過40mg為宜，并經間接致癌物(1，8-二羥基蒽醌50.0μg/皿及二氨基芴10.0μg/皿)鑒定其生物活性合格后儲存于深低溫或冰凍干燥,保存期不超過1年。

溶劑對照：蒸餾水。陽性對照：非活化系統TA97、TA98、TA102為敵克松50.0μg/皿，TA100為疊氮鈉1.5μg/皿。活化系統TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0μg/皿，TA102為1，8-二羥基蒽醌50.0μg/皿。

稱取樣品2.5g加蒸餾水至50mL，混均即為5000μg/皿劑量組受試液，吸取該液25mL加蒸餾水至50mL混均即為2500μg/皿劑量組受試液，同法配制其他劑量組受試液。上述受試液經0.103MPa，20min滅菌后使用。試驗設313、625、1250、2500、5000μg/皿5個劑量。在頂層瓊脂中加入0.1mL試驗菌株增菌液、0.1mL受試物溶液，代謝活化時加入0.5mL S9混合液，混勻后倒入底層培養基平板上。在37℃培養48h，計數每皿回變菌落數。如果受試物的回變菌落數是自發回變菌落數2倍以上，并具有劑量—反應關系者則定為陽性。每個劑量做3個平行。整套試驗在相同條件下重復做2次并分別統計。

2 實驗與分析

2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果

表1 小鼠骨髓PCE微核試驗結果

經卡方檢驗，各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，陽性對照組與陰性對照組比較有高度顯著性差異(P<0.01)，各組動物

PCE/RBC值方差分析無顯著性差異。

2.2 小鼠精子畸形試驗結果

表2 小鼠精子畸形試驗結果

經Wilconson秩和檢驗，各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較無顯著差異(P﹥0.05)，陽性對照組與陰性對照組比較有高度顯著性差異(P﹤0.01)。

2.3 Ames試驗結果

2.3.1 第一次試驗結果

表3 Ames試驗結果(第一次)

2.3.2 第二次試驗結果

表4 Ames試驗結果(第二次)

本實驗條件下，樣品Ames試驗結果為陰性。

3 結論

本實驗按照《食品安全性毒理學評價程序和方法》[5]對長白山有機靈芝提取物進行了小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和Ames試驗。

該樣品骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果為陰性，各動物未見細胞毒性作用。該樣品精子試驗結果為陰性。本實驗條件下，樣品Ames試驗結果為陰性。

[1]林志彬.靈芝抗腫瘤活性和免疫調節作用的研究進展[J].北京大學學報:醫學版,2002,34(5):493-498.

[2]YouYuhong,LINZhi bin.Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrohages induced by reac-tive oxygen species[J].Acta Pharmacol Sinica, 2002,23(9):787-791.

[3]吳鋒,孟國梁,楊麗云,等.靈芝多糖預防大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究[J].南通大學學報:醫學版,2008,28(4):251-252.

[4]陳偉強,黃際薇,羅利瓊,等.靈芝多糖調節糖尿病大鼠血糖、血脂的實驗研究[J].中國老年學雜志,2005,25(8):957-958.

[5]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.1-2003食品安全性毒理學評價程序和方法[S].2003.

[6]龔晨睿，潘思鐵.特異性雞蛋抗體的毒理學安全性研究[J].食品科學，2006,17(1)：226-230.

[7]姜瑋，張博超，邵薇璇，等.熊果酸對小鼠體細胞的遺傳毒性研究[J].食品科學，2008,29(11)：585-587.

3 總結

試驗結果表明，對核桃星天牛幼蟲施用不同藥劑，均可取得很好的防治效果，即在星天牛幼蟲發生期，施用80%的敵敵畏乳油10倍液、40%的樂果10倍液、56%的磷化鋁0.2～0.3g，防治效果分別為91.71%、90.20%、92.86%，均達到90%以上，防治效果良好。

參考文獻

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[3]敖特根,于春,張恩,等.樹干打孔注藥防治青楊天牛試驗[J].內蒙古林業科技,2006(1):20-21.

[4]郭新榮.光肩星天牛寄主空間生態位選擇性研究[J].西北林業學院報,2007，22(6):89-91.

[5]王志剛,黃大慶,閻俊杰,等.東北地區光肩星天牛的發生動態[J].東北林業大學學報,2005，33(6):89-91.

S567.3+1

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林花(1981-),女 , 助理研究員,主要從事天然產物的功效與毒理安全性研究，Email：23124951@qq.com；*通訊作者：金龍哲。

2016-08-16

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.06.009