有機靈芝破壁孢子粉增強免疫力功能的實驗研究

金龍哲，車成來，王霞，王宇輝，王欣宇，林花

(延邊州農業科學院，吉林延吉133001)

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有機靈芝破壁孢子粉增強免疫力功能的實驗研究

金龍哲，車成來，王霞，王宇輝，王欣宇，林花＊

(延邊州農業科學院，吉林延吉133001)

選用小鼠為實驗對象，隨機分成實驗組和對照組。實驗組分別按3.33g、6.67g、20.00g加蒸餾水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw體積給小鼠灌胃，每天1次，連續灌胃至少30d。對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。進行遲發型變態反應、ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗、抗體生成細胞檢測、半數溶血值(HC50)的測定、小鼠碳廓清實驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、NK細胞活性的測定實驗。結果表明：經口灌胃給予小鼠不同劑量的靈芝破壁孢子粉30d，能顯著提高小鼠遲發型變態反應能力、NK細胞活性、抗體生成細胞數、半數溶血值。靈芝破壁孢子粉具有增強小鼠免疫力作用。

有機靈芝；破壁孢子粉；免疫調節；小鼠

靈芝孢子粉(Ganodermaspore)，是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌蓋彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞即靈芝的種子。每個靈芝孢子只有4～6μm，是活體生物體，雙壁結構，外被堅硬的幾丁質纖維素所包圍，人體很難充分吸收。破壁后更適合人體腸胃直接吸收，它是靈芝的精華部分，具有靈芝的全部遺傳物質和保健作用[1]。它具有增強機體免疫力[2]、抑制腫瘤[3]、 降血糖[4]、降血脂[5]、護肝[6]、 抗病毒[7]、抗輻射等多種藥理作用。 長白山有機靈芝是在長白山區獨特的冷涼氣候條件下按國際有機靈芝栽培規范栽培的有機靈芝[G.lucidum(Leyss ex Fr.)Krast]，本研究利用長白山有機靈芝破壁孢子粉對實驗小鼠進行了免疫調節功能試驗，為其功能性食品的開發利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣品：由延邊州農業科學院農特產品加工研究所提供，人口服推薦劑量為每日4g，成人體重按60kg計算，折合劑量0.0667g/kg·bw。

1.2 實驗動物與分組：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(實驗動物生產許可證號為SCXK(湘)2011-0003)提供的SPF級ICR種雌性小鼠200只，體重18～22g。每40只小鼠為1大組，共5大組。免疫Ⅰ組，進行碳廓清實驗；免疫Ⅱ組，進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗、NK細胞的活性測定；免疫Ⅲ組，進行臟體比值測定、半數溶血值(HC50)的測定和抗體生成細胞數的測定；免疫Ⅳ組，進行遲發型變態反應實驗；免疫Ⅴ組，進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。每大組40只小鼠按體重隨機分為4小組，即對照組和低、中、高劑量組。

1.3 實驗條件：為屏障環境，實驗期間環境溫度23～24℃，濕度54%～58%，實驗動物使用許可證號為SYXK(湘)2010-0011。

1.4 劑量選擇及樣品處理：據人體口服推薦量，設有機靈芝破壁孢子粉低、中、高劑量分別為0.333、0.667、2.000g/kg·bw(分別相當于人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍)。試驗時，分別取有機靈芝破壁孢子粉3.33、6.67、20.00g加蒸餾水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw體積給小鼠灌胃，每天1次，連續灌胃至少30d。對照組灌胃予以等體積的蒸餾水。

1.5 主要儀器與試劑

動物臺秤、分析天平、潔凈工作臺、二氧化碳培養箱、離心機、722分光光度計、恒溫水浴箱、酶標儀、顯微鏡等。

無菌手術器械、游標卡尺、微量注射器、細胞計數器、24孔和96孔平底細胞培養板、96孔U型細胞培養板、玻璃平皿、紗布、試管、玻片架、200目篩網、計時器、血色素吸管、載玻片等。

SRBC、生理鹽水、Hank’s液、RPMI1640培養液、小牛血清、青鏈霉素、ConA、1%冰醋酸、1mol/L的HCl溶液、酸性異丙醇、MTT、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、補體(豚鼠血清)、SA緩沖液、瓊脂糖、都氏試劑、YAC-1細胞、乳酸鈉、硝基氧化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%碳酸鈉、雞紅細胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.6 實驗方法

1.6.1 臟器/體重比值測定。稱重后處死小鼠，取出脾臟和胸腺，在電子分析天平上稱重，計算臟/體比值。

1.6.2 遲發型變態反應(DTH)(足跖增厚法)。小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC(0.2mL/每鼠)致敏后4天，測量左右足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC(20μL/每鼠),于注射后24h測量左右足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度[3]。

1.6.3 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗(MTT法)。無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，制成細胞懸液，經200目篩網過濾。用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細胞懸浮于1mL完全培養液中，計數活細胞數，用RPMI1640培養液調整細胞濃度為3×106個/mL。再將細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1mL，在其中一孔加75μLConA液(相當于7.5μg/mL)，另一個孔作為對照，置5%二氧化碳培養箱，37℃培養72h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養液，同時加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板中，每孔作3個平行孔，用酶標儀，以570nm波長測定光密度值。淋巴的增值能力用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值表示[8]。

1.6.4 抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心(2000r/min)，將壓積SRBC用生理鹽水配成2%(v/v)的細胞懸液，200目篩網過濾，洗滌、離心2次，最后將細胞懸浮在8 mLHank’s液中，計數細胞，并將細胞濃度調整為5×106個/ mL。將表層培養基加熱溶解后與等量的pH7.4/2倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內加入用SA液配制的10%SRBC 50μL(v/v)、20μL脾細胞懸液(5×106個/mL)，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，待瓊脂糖凝固后將玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培養箱中溫育1.5h，然后用SA液稀釋的補體(1∶8)加入到玻片凹槽內，繼續溫育1.5h后計數溶血空斑數。

1.6.5 半數溶血值(HC50)的測定。取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經腹腔注射2%(v/v，用生理鹽水配制)SRBC 0.2mL進行免疫。4天后，摘除眼球取血于離心管內，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000rpm離心10min，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋為200倍，取1mL置試管內，依次加入10%(v/v，用SA緩沖液配制)SRBC 0.5mL，補體1mL(用SA緩沖液按1∶8稀釋)。另設不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30min后，冰浴終止反應。2000rpm離心10min，取上清1mL，加都氏試劑3mL。同時取10%(v/v，用SA緩沖液配制)SRBC0.25mL，加都氏試劑至4mL于另一試管中，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數溶血值(HC50)表示，按下式計算：半數溶血值(HC50)=樣品光密度值/SRBC半數溶血時的光密度值×稀釋倍數

1.6.6 小鼠碳廓清實驗。小鼠尾靜脈注射以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，每10g體重注射0.1mL，墨汁注入后立即計時，于注入墨汁后第2、10min，分別從內眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1%Na2CO3溶液作空白對照，用722型分光光度計在600nm波長處比色測光密度值。將小鼠處死，取肝、脾，稱重，計算吞噬指數a。

1.6.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法)。小鼠腹腔注射20%(v/v，用生理鹽水配制)的雞紅細胞(2000rpm,10min)懸液1mL，間隔30min,頸椎脫臼處死，仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經腹腔注入生理鹽水2 mL，轉動鼠板1min。取腹腔巨噬細胞洗液1mL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗以除去未貼片細胞。晾干，以甲醇∶丙酮(1∶1)固定，4%(v/v) Giemsa-磷酸緩沖液染色，用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下每片計數100個巨噬細胞，按下式計算巨噬率和吞噬指數：吞噬率%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數×100吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞數

1.6.8 NK細胞活性的測定(乳酸脫氫酶測定法)。受試小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細胞懸液，用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000轉/min)，棄上清液將細胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水20s，裂解紅細胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000rpm離心10min，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數，用臺酚蘭染色計數活細胞數(活細胞數應在95%以上)，調整細胞濃度為2×107個/mL此為效應細胞，取傳代后24h生長良好的YAC-1細胞用PRMI1640完全培養液調整細胞濃度為4×105個/mL 此為靶細胞；取靶細胞和效應細胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%Triton各100μL；上述各項均設3個平行孔，于37℃,5%二氧化碳培養箱中培養4h，然后將96孔培養板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100μL，根據室溫反應3～10min，每孔加入1mol/L的HCI30μL，在酶標儀490nm處測定光密度(OD)。

NK細胞活性=〔(反應孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)〕×100%

1.7 實驗數據統計

用Eecel、Spss軟件進行數據轉化和統計分析。用Spss13.0軟件分析時，先對數據進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異再用Dunnett法進行多個劑量組與1個對照組均數間的兩兩比較。若方差不齊則對原始數據進行適當的變量轉換，滿足方差齊性檢驗后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到方差齊，則改用秩和檢驗進行統計，發現總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane’s T2檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 樣品對小鼠體重的影響

見表1～5，各劑量組實驗初期、實驗中期、實驗末小鼠體重及試驗期間小鼠體重增長與對照組比較，差異均無顯著性(P﹥0.05)。

表1 免疫Ⅰ組小鼠體重

表2 免疫Ⅱ組小鼠體重

表3 免疫Ⅲ組小鼠體重

表4 免疫Ⅳ組小鼠體重

表5 免疫Ⅴ組小鼠體重

2.2 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

見表6。樣品各劑量對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著影響(P﹥0.05)。

表6 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

2.3 樣品對小鼠細胞免疫功能的影響

2.3.1 樣品對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響。見表7。中、高劑量組小鼠遲發型變態反應能力與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表7 樣品對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響

2.3.2 樣品對小鼠ConA誘導的淋巴細胞轉化能力的影響。見表8。樣品各劑量對小鼠淋巴細胞轉化能力無顯著影響(P﹥0.05)。

表8 樣品對小鼠淋巴細胞轉化能力的影響

2.4 樣品對小鼠體液免疫的影響

2.4.1 樣品對小鼠抗體生成細胞數的影響。見表9。中、高劑量組小鼠抗體生成細胞數與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表9 樣品對小鼠抗體生成細胞數的影響

2.4.2 樣品對小鼠半數溶血值(HC50)的影響。見表10。高劑量組小鼠半數溶血值(HC50)與對照組比較顯著提高(P﹥0.05)。

表10 樣品對小鼠半數溶血值(HC50)的影響

2.5 樣品對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

2.5.1 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清的影響。見表11。各劑量組對小鼠碳廓清能力的影響(P﹥0.05)。

表11 樣品對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清的影響

2.5.2 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響。見表12-1、12-2。樣品各劑量對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力無顯著影響(P﹥0.05)。

表12-1 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬 雞紅細胞吞噬率的影響

表12-2 樣品對小鼠巨噬細胞吞噬 雞紅細胞吞噬指數的影響

2.6 樣品對小鼠NK細胞活性的影響

見表13。中、高劑量組對小鼠NK細胞活性與對照組比較顯著提高(P﹤0.05)。

表13 樣品對小鼠NK細胞活性的影響

3 結論

在本實驗室條件下，經口灌胃給予小鼠0.333、0.667、2.000g/kg·bw劑量的有機靈芝破壁孢子粉30天，與對照組比較，0.667、2.000g/kg·bw劑量能顯著提高小鼠遲發型變態反應能力、NK細胞活性、抗體生成細胞數，2.000g/kg·bw劑量能顯著提高小鼠半數溶血值(P﹤0.05)，各劑量對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、單核-巨噬細胞碳廓清能力、淋巴細胞轉化能力及巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力均無顯著影響(P﹥0.05)。本研究通過測定小鼠遲發型變態反應、ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗、抗體生成細胞檢測、半數溶血值(HC50)的測定、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、NK細胞活性等指標，分析長白山有機靈芝破壁孢子粉對實驗小鼠的免疫功能作用。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003)判定，有機靈芝破壁孢子粉對小鼠具有提高免疫力功能。

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2016-08-24

金龍哲(1965-),男,副研究員,主要從事天然產物提取和功效成分研究；*通訊作者：林花，助理研究員， E-mail：23124951@qq.com。

S567.3+1

A

DOI.:11.13268/j.cnki.fbsic.2016.06.005