納米金標記細胞的熒光壽命成像及其三維重建

姚翠萍,周湘連,王晶,王波,黃康,張鎮西

(西安交通大學生物醫學信息工程教育部重點實驗室, 710049, 西安)

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納米金標記細胞的熒光壽命成像及其三維重建

姚翠萍,周湘連,王晶,王波,黃康,張鎮西

(西安交通大學生物醫學信息工程教育部重點實驗室, 710049, 西安)

為了研究在基于納米金的腫瘤光動力學療法以及腫瘤熱療中納米金在細胞中的分布及代謝,利用多光子熒光顯微鏡技術對在熱療中納米金結合的腫瘤細胞進行了多次掃描成像,并采用一種基于區域的活動輪廓模型圖像分割算法,對與納米金結合的細胞的多光子熒光顯微圖像進行處理,在一幅具有多個細胞的圖像中分割出單個細胞的輪廓。根據細胞斷層切片圖像的輪廓采用移動立方體算法,對細胞進行三維重建,繪制出細胞表面的三維模型,再利用納米金的熒光壽命和光強來標定納米金在細胞具體位置的分布。結果表明,在一定時間內,納米金會進入細胞并在不同的區域內呈現一定的分布。這與抗原抗體結合會導致抗體的內化,從而使納米金進入細胞內的事實相符。這種技術將會為更加直觀、全面地研究納米金與細胞的相互作用以及納米金在細胞內具體位置(比如某個細胞器內的分布)提供一種可行的方法。

熒光壽命成像;金納米微粒;三維重建

多光子顯微成像對于癌癥的早期診斷是一種強有力的技術手段,它能夠非侵入式地對組織里上百微米深處亞細胞特征進行成像[1]。多光子顯微成像在三維分辨率、探測深度、信噪比等方面的優點都是以往的激光顯微鏡不具備的,其成像原理見圖1。通過對非熒光觀測目標注入熒光造影劑,就能夠對多種其他生物分子特征進行多光子顯微成像,從而更好地監測癌細胞[2]。傳統的有機染料是最早使用的造影劑之一,它能夠發出明亮的熒光,可以用于細胞質和細胞核的標記,但是它的抗光漂白能力差。熒光半導體量子點具有較寬的吸收波長范圍,但是卻有潛在的細胞毒性,使得它不適合在體臨床應用[1]。另一類熒光造影劑金屬納米粒子,不僅具有較高的熒光發光效率,而且與細胞有著很好的生物相容性。以金納米顆粒作為熒光造影劑,與多光子顯微成像結合進行生物醫學成像是目前的研究熱點[3-5]。另外,納米金目前在選擇性光熱治療、藥物遞送方面的研究也取得了很大的進展[6],但是目前納米金的代謝機理還不是很清楚,這使其應用于臨床受到了限制。在納米金輔助的光動力療法中,由于納米金的分布不清楚,導致納米金在細胞內的局域場增強效應無法發揮的原因也無法確定[7]。因此,納米金在細胞內的分布有助于提高納米金輔助的光動力療法,并對納米金在活體內的代謝通路研究有所促進,進而推進納米金體內代謝的研究進展。

在納米金輔助的光動力療法中,納米金結合的光敏劑被細胞吸收后,光照射的結果可以使光動力效果提高,但是卻沒有發揮納米金等離子體共振效應[7],可能的原因是進入細胞后,納米金和光敏劑分布在細胞的部位不同。

圖1 多光子顯微成像系統示意圖

本文利用抗原抗體把納米金特異性結合到卵巢癌細胞OVCAR3上,孵育15 min,然后利用多光子熒光顯微鏡的熒光壽命成像,對細胞進行多層掃描成像,獲得一系列的二維圖形。最后,利用圖像分割算法,劃分出單個細胞輪廓,并進行三維重建,利用熒光壽命的長短以及光強標定納米金在細胞中或細胞表面的具體分布。如果再對不同的細胞器標記不同熒光壽命的染料,利用同樣的方法,就可以定位納米金在具體細胞器中的分布,與光敏劑所在部位進行比較,就可以獲得其具體的分布信息。這種方法對于研究納米金與細胞膜的相互作用以及納米金的代謝通路提供了一種有力的工具。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

實驗中所使用的卵巢癌細胞OVCAR3從美國模式培養中心(ATCC)獲得,貼壁生長在含有10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪磺酸(Hepes)和1 mmol/L的L-谷氨酰胺的培養基RPMI-1640(Sigma,USA)中,其中還加入了體積分數為10%的胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素(PAA,USA)以及1.5 g/L的碳酸氫鈉,置于37 ℃的培養箱中進行培養,CO2與空氣的體積分數分別為5%、95%,培養環境相對飽和濕度為95%。

把細胞培養在培養瓶中,當細胞基本鋪滿瓶底的時候,用質量分數為0.25%的胰蛋白酶(含有Ethylene Diamine Tetraacetie Acid(EDTA),Sigma)消化細胞5 min,并對其在20 ℃以21 100 g的速度離心20 min,以2.0×105mL-1的密度懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。接著以細胞與納米金個數比等于1∶104的濃度加入結合有Erbitux抗體的30 nm納米金(British Biocell International公司)和細胞上對應的表面生長因子受體(EGFR)反應,在培養箱中培養15 min后,沖洗掉多余的納米金,將樣品拿到多光子熒光顯微鏡下進行熒光壽命成像。

1.2 熒光壽命成像

成像所用設備為德國JenLab公司的DermaInspect多光子顯微成像系統。系統包括一個固態鎖模鈦寶石激光器(MaiTai,Spectra Physics,Darmstadt,德國),波長從710～920 nm可調,頻率為80 MHz,800 nm時的平均輸出功率大于900 mW,脈寬為75 fs。掃描模塊包括電動光束衰減器、雙軸電控掃描儀、壓電驅動,工作距離為140 μm的物鏡(Plan Neofluar×40,NA 1.3,Zeiss,Goettingen,德國)等。通過二向色鏡和低通濾波片(BG39,Schot,Mainz,德國)對激發光和背景噪聲進行濾除,發光信號由光電倍增管模塊(H7732-01,hamamatsu,Herrsching,德國)進行探測[8-9]。熒光壽命成像模塊是通過時間關聯單光子計數法來測量的[10-11]。

1.3 圖像分割與細胞三維重建

測試獲得二維的熒光壽命成像結果,其視野內一般不會只有一個細胞,因此首先要把每個細胞分割出來,再進行重建。對于細胞的分割,本文采用了文獻[12]提出的一種基于局部區域的活動輪廓模型算法。在此模型中,圖像分割是在一個較小的局部區域里劃分出前景和背景。首先,需要建立一個合適形狀的初始化輪廓,初始化輪廓用水平集表示,根據所選模型(例如chan-vese模型)計算初始化輪廓上每個點的局域化能量。然后,通過均值區分方法,使局部能量最優化,進行曲線演化,最終達到使曲線上所有點的總能量最小。這時,經過一系列曲線演化所得到的分割結果就是目標細胞的外輪廓。

細胞的三維重建采用的是移動立方體(MC)算法,是一種三維等值面重建算法,它是由文獻[13]提出來的。在醫學成像領域里,MC算法是最常用的面繪制三維重建算法,采用分而治之的方法,以上下兩層切片的8個像素點形成的立方體為單位對所有的切片數據進行逐個處理。每個立方體與設定的閥值相比較,在立方體里形成一個三角形表面,所有三角形連成網狀結構,就構成了三維表面。

1.4 納米金細胞內空間分布標記

在熒光壽命成像中,通過對所采集的數據與所設定的模型(特定函數)進行擬合,使數據和模型之間的方差最小,其中每個點可以由幾個不同的發色團疊加。在本測量中,對任意一點設置為兩個發色團的疊加(納米金和細胞)。因此,在對納米金進行空間標記的時候,同時設置3個條件:熒光壽命小于200 ps,每個像素中短壽命占比例大于80%,每個像素強度大于150(根據圖像獲得任意單位)。只有滿足以上3個條件,才認為某個點是納米金。最后,把獲得的細胞三維模型與納米金的分布模型進行疊加,就可以得到納米金在細胞中的分布。

2 實驗結果

2.1 熒光壽命成像

(a)熒光壽命成像偽彩圖

(b)熒光壽命成像強度

(c)熒光壽命分布直方圖圖2 結合有納米金的細胞的熒光壽命成像

納米金標記的OVCAR3細胞的發光強度、偽彩色熒光壽命和熒光壽命分布如圖2所示。所使用的激發波長為750 nm,激發功率為25 mW。從圖中可知,納米金分布在細胞上。根據文獻報道,納米金的熒光壽命小于100 ps[14]。由于儀器最小分辨率為180 ps,而根據細胞各部分的熒光壽命均在納秒級[15-16],可以認為系統中熒光壽命小于180 ps的成分主要來自納米金,后續程序中還會根據其強度的大小對其進一步限制。從獲得的偽彩熒光壽命圖像和其相應的熒光壽命分布直方圖可以看出,熒光壽命小于200 ps的部分可以代表納米金,而細胞的熒光壽命通常大于1 500 ps。對于一個樣品,在縱軸方向上每隔0.4 μm掃描一次,獲得一副二維圖像,要獲得完整的一個細胞就要進行大約50多次的掃描,在每一個深度上都獲得一個二維圖像。

2.2 圖像分割與三維重建

進行圖像分割的目的是劃分出圖像中目標細胞的外輪廓用于細胞表面三維重建。為了方便進行三維重建,分割出來的輪廓要求是閉合的曲線。通過比較閾值分割、Canny算子、Log算子、區域生長、模糊聚類等算法,本文最終選擇了活動輪廓模型算法。該算法雖然速度稍慢,但是滿足對圖像輪廓精確劃分的要求,且能進行局部分割。當需要在一幅包含多個類似目標的圖像中分割出感興趣的目標時,這個模型的分割效果尤其好。目標細胞分割以及三維重建算法都通過Matlab平臺實現。圖3是根據活動輪廓算法對圖像中的一個目標細胞進行分割的結果,對其余的50多幀圖像都進行了同樣的分割,然后將所有的分割結果進行三維重建,組成一個細胞的完整三維模型,如圖4所示。

(a)熒光壽命成像偽彩圖

(b)灰度化并選定目標細胞

(c)目標細胞分割后結果圖3 對感興趣細胞的分割過程

圖4 重構后的細胞三維模型

2.3 納米金在細胞的空間分布

根據前述的方法獲得了如圖5所示納米金在三維細胞內的空間分布圖。從圖中可以看出,經過15 min培育后,大部分納米金已經進入細胞內部,而細胞膜表面上的納米金只占了少部分。這些分布從動態三維圖中可以分辨得更清楚。

圖5 納米金在三維細胞內的空間分布

3 討論與結論

多光子顯微鏡為觀察完整組織等比較厚的樣品中的活細胞提供了一個很好的工具[17]。這項技術為很多不方便成像或者不能提供有用信息的實驗提供了一種可能性。納米金的多光子發光被認為是等離子體輔助成像、光熱治療以及觀察細胞器的一種最重要的工具之一[18-20]。通過多光子顯微鏡,在生理條件下可以直接觀察到納米金,同時通過熒光壽命成像可以很清楚地分辨出納米金和細胞的自體熒光。而且,由于在多光子激勵中,當物鏡數值孔徑在1.2～1.4時,熒光總能量的80%來自于物鏡焦點700～1 000 nm厚度的范圍內,這么窄范圍的多光子激勵只會誘導焦點處的物質發光。因此,當使用激光掃描多光子熒光顯微鏡在z軸方向上以0.4 μm的間隔進行成像時,就可以獲得納米金在細胞內的具體分布。從圖3、圖5可以看出,納米金有的分布在細胞膜上(顏色不同),有的分布在細胞內部,這是因為表皮生長因子受體在連接配體后會很快被內化[21]。

此外,從圖5可以看出,通過利用熒光壽命和光強進行標記,可以比較清楚地觀察到納米金在細胞內的分布,并且分布并不均勻,也許這和OVCAR3細胞膜上的表面生長因子受體分布有關,也可能和納米金進入細胞后形成內吞泡有關,具體的原因需要進一步研究。如果納米金不和細胞上的受體結合,只是單純地和細胞進行一定時間的培育,此時要使納米金進入細胞可能需要比較長的時間,其在細胞內的分布也會有所不同,即使這樣,本文算法同樣適用。除此之外,還可以用于其他情況,比如納米金的穿膜載藥等。

在算法方面,基于局部區域的活動輪廓模型對于初始化輪廓較為敏感,所以初始化輪廓應盡量接近目標輪廓,本文采用圓形或者橢圓形能達到良好的分割效果,同時也能提高分割效率。實驗中,改變z軸距離進行成像,可能會使細胞發生位移,分割所得每層圖像中目標細胞的外輪廓可能不在一條軸線上,所以有時需要對軸線進行校正才能保證三維重建得到正確的結果。由于圖像分割算法采用水平集描述活動輪廓,運算量較大,運行時間相對較慢,但對于不要求實時進行的圖像后處理階段還是可以接受的。后期可以通過c-Matlab聯用或者并行算法提高運算速率,節省運算時間。三維細胞以及納米金分布后期還可以通過一些專業軟件進行精細渲染,并添加一些旋轉、平移、縮放功能,實現良好的視覺和互動效果。

本文的最終目的是想了解納米金在細胞內的具體位置,包括具體的細胞器等的分布,因此后續研究中還需對不同的細胞器進行標記,將納米金的細胞器分布進行重合才會有進一步的發現。而且,如果要對納米金細胞內的代謝進行研究時,還需在不同時間段內進行標記研究,才能發現更有意義的現象,得出更有價值的結論。

[1] KONIG K, RIEMANN I. High-resolution multiphoton tomography of human skin with subcellular spatial resolution and picosecond time resolution [J]. Journal of Biomedical Optics, 2003, 8(3): 432-439.

[2] DURR N J, LARSON T, SMITH D K, et al. Two-photon luminescence imaging of cancer cells using molecularly targeted gold nanorods [J]. Nano Lett, 2007, 7(4): 941-945.

[3] QU X C, WANG J, YAO C P, et al. Two-photon imaging of lymphoma cells targeted by gold nanoparticles [J]. Chinese Optics Letters, 2008, 6(12): 879-881.

[4] WANG H, HUFF T B, ZWEIFEL D A, et al. In vitro and in vivo two-photon luminescence imaging of single gold nanorods [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(44): 15752-15756.

[5] QU Xiaochao, NORBERT K, LI Z, et al. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of Karpas 299 cells using ACT1 antibody conjugated gold nanoparticles [C]∥Proc SPIE 6630. Washington, DC, USA: SPIE, 2007: 66301C.

[6] QIN Z, BISCHOF J C. Thermophysical and biological responses of gold nanoparticle laser heating [J]. Chem Soc Rev, 2012, 41(3): 1191-1217.

[7] ZHANG Z X, WANG S J, XU H, et al. Role of 5-aminolevulinic acid-conjugated gold nanoparticles for photodynamic therapy of cancer [J]. Journal of Biomedical Optics, 2015, 20(5): 0510431-0510438.

[8] BECKER A W, BERGMANN A, KONIG K, et al. Picosecond fluorescence lifetime microscopy by TCSPC imaging [C]∥Proc SPIE 4262. Washington, DC, USA: SPIE, 2001: 4262.

[9] KONIG K, BECKER T W, FISCHER P, et al. Pulse-length dependence of cellular response to intense near-infrared laser pulses in multiphoton microscopes [J]. Opt Lett, 1999, 24(2): 113-115.

[10]PHILIP J, CARLSSON K. Theoretical investigation of the signal-to-noise ratio in fluorescence lifetime imaging [J]. J Opt Soc Am: A, 2003, 20(2): 368-379.

[11]BECKER W, STIEL H, KLOSE E. Flexible instrument for time-correlated single-photon counting [J]. Rev Sci Instrum, 1991, 62(12): 2991-2996.

[12]LANKTON S, TANNENBAUM A. Localizing region-based active contours [J]. IEEE Transactions on Image Processing, 2008, 17(11): 2029-2039.

[13]LORENSEN W E, CLINE H E. Marching cubes: a high resolution 3D surface construction algorithm [J]. ACM Siggraph Computer Graphics, 1987, 21(4): 163-169.

[14]ZHANG Y A, YU J, BIRCH D J S, et al. Gold nanorods for fluorescence lifetime imaging in biology [J]. Journal of Biomedical Optics, 2010, 15(2): 0205041-0205043.

[15]QU X C, WANG J, ZHANG Z X, et al. Imaging of cancer cells by multiphoton microscopy using gold nanoparticles and fluorescent dyes [J]. Journal of Biomedical Optics, 2008, 13(3): 0312171-0312177.

[16]劉超, 周燕, 王新偉, 等. 熒光壽命成像技術及其研究進展 [J]. 激光與光電子學進展, 2011, 48: 1111021 -1111026. LIU Chao, ZHOU Yan, WANG Xinwei, et al. Fluorescence lifetime imaging microscopy and its research progress [J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2011, 48: 1111021-1111026.

[17]LEBLOND F, DAVIS S C, VALDES P A, et al. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: review of instruments, methods and applications [J]. Journal of Photochemistry and Photobiology: B Biology, 2010, 98(1): 77-94.

[18]EICHELBAUM M, KNEIPP J, SCHMIDT B E, et al. SERS and multiphoton-induced luminescence of gold micro-and nanostructures fabricated by nir femtosecond-laser irradiation [J]. ChemPhysChem, 2008, 9(15): 2163-2167.

[19]李政, 張鎮西. 納米金標記活細胞雙光子熒光成像研究 [J]. 深圳大學學報: 理工版, 2008, 25(3): 248-251. LI Zheng, ZHANG Zhenxi. Two-photon fluorescence imaging of cationic gold nanoparticles labeled fibroblasts and its application [J]. Journal of Shen Zhen University: Science and Engineering, 2008, 25(3): 248-251.

[20]MARTI D, STOLLER P, RUOSCH M, et al. Combined scattering confocal and multiphoton luminescence imaging of gold nanospheres [C]∥Proc SPIE 68690K. Washington, DC, USA: SPIE, 2008: 68690K.

[21]WANG Q, VILLENEUVE G, WANG Z. Control of epidermal growth factor receptor endocytosis by receptor dimerization, rather than receptor kinase activation [J]. EMBO Rep, 2005, 6(10): 942-948.

(編輯 杜秀杰)

Fluorescence Life Imaging of Gold Nanoparticle-Labeled Cells and Its 3D Reconstruction

YAO Cuiping,ZHOU Xianglian,WANG Jing,WANG Bo,HUANG Kang,ZHANG Zhenxi

(Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

To analyze the distribution and metabolism of gold nanoparticles in cells during the gold nanoparticles-based photodynamic therapy and photo-thermal therapy, the multiphoton fluorescence microscopy was used to image the gold nanoparticles labeled cells, and a region-based active contour model image segmentation algorithm was chosen to process the multiphoton fluorescence images of gold nanoparticles labeled cell. 60 thin slice images were reconstructed for a 3D cell image to draw a three-dimensional model of cell surface. The locations of gold nanoparticles in or on the cell were marked according to the fluorescence lifetime and intensity of gold nanoparticles. The results show that the gold nanoparticles can get into the cells, which is in accordance with the fact that antibody is internalized when the antibody combines with antigen. This technology is expected to more comprehensively investigate the interaction between gold nanoparticles and cell as well as the specific distribution of gold nanoparticles, for instance, in a certain cell organelle.

fluorescence lifetime imaging; gold nanoparticle; 3D reconstruction

2015-07-15。 作者簡介:姚翠萍(1971—),女,副教授。 基金項目:國家自然科學基金資助項目(61575156);國家自然科學基金重大國際(地區)合作研究資助項目(61120106013)。

時間:2016-01-04

10.7652/xjtuxb201604023

R318.15

A

0253-987X(2016)04-0153-06

網絡出版地址:http:∥www.cnki.net/kcms/detail/61.1069.T.20160104.1837.004.html