siRNA下調Gli基因表達對肺鱗癌SK- MES- 1細胞生物學行為的影響

米源，杜媛鯤，劉慶熠，廖海江，王林，王雷

(1.河北醫科大學第四醫院 胸二科，河北 石家莊 050011； 2.河北醫科大學 期刊社，河北 石家莊 050017)

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·論 著·

siRNA下調Gli基因表達對肺鱗癌SK- MES- 1細胞生物學行為的影響

米源1，杜媛鯤2，劉慶熠1，廖海江1，王林1，王雷1

(1.河北醫科大學第四醫院 胸二科，河北 石家莊 050011； 2.河北醫科大學 期刊社，河北 石家莊 050017)

目的:探討Gli表達下調對肺鱗癌SK- MES- 1細胞周期分布和上皮- 間質轉化能力的影響及其分子機制。方法：將Gli1和Gli2 siRNA與空白對照siRNA分別轉染SK- MES- 1細胞48 h，實時熒光定量PCR法檢測Gli1、Gli2 mRNA表達水平；Western blot法檢測SK- MES- 1細胞Gli1、Gli2、Cyclin D1、Cyclin E、E- cadherin、N- cadherin蛋白的表達；流式細胞術檢測SK- MES- 1細胞周期分布；Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。結果：與空白對照siRNA組相比，Gli1和Gli2 siRNA可明顯抑制SK- MES- 1細胞Gli1、Gli2 mRNA及蛋白表達，下調Cyclin D1、Cyclin E、N- cadherin蛋白的表達，增加E- cadherin蛋白表達，將細胞周期明顯阻滯在G0/G1期并降低細胞的侵襲能力，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論：Gli蛋白表達可能在肺鱗癌的發生發展中具有重要作用，Gli1和Gli2表達下調可導致肺鱗癌細胞周期分布和上皮- 間質轉化能力的改變，這可能與Cyclin D1、Cyclin E、E- cadherin、N- cadherin蛋白變化相關。

肺鱗癌； Gli； 細胞周期； 上皮- 間質轉化

肺癌又稱支氣管肺癌，是全球范圍內癌癥相關性死亡的首位原因[1]。非小細胞肺癌(non- small- cell carcinoma，NSCLC)包括鱗癌、腺癌和大細胞癌等多種病理類型，約占每年新發肺癌的85%，其中肺鱗癌占非小細胞肺癌總數的30%[2]。肺鱗癌的主要治療方法仍舊采取以外科手術為主放化療為輔的綜合治療，但晚期NSCLC患者的預后仍差強人意。

肺癌的發生發展是一個多階段、多因素和多條基因信號傳導通路參與的復雜過程，基因的異常改變可導致細胞惡性轉化。近年來研究發現，Hedgehog(Hh)信號傳導通路在卵巢癌[3]、非霍奇金淋巴瘤[4]、肝癌[5]和前列腺癌[6]等多種腫瘤組織中異常激活，與惡性腫瘤的發生發展及侵襲轉移密切相關。Gli作為Hh信號通路的關鍵組分包括Gli1、Gli2和Gli3。Gli3是該通路的轉錄抑制因子，而Gli1和Gli2作為主要的轉錄激活因子在多種腫瘤中異常高表達且參與調控下游多種靶基因的表達，在腫瘤的發生及發展中發揮重要作用。目前國內外關于Hh/Gli異常激活與鱗癌細胞周期和上皮- 間質轉化的關系研究極少，本研究應用siRNA下調肺鱗癌SK- MES- 1細胞中Gli1和Gli2的表達，旨在研究Gli和肺鱗癌細胞生長轉移的關系，為肺鱗癌的分子靶向治療提供新依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源 人肺鱗癌細胞系SK- MES- 1購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要實驗儀器及試劑 RPMI- 1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫藥股份有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；SilencerTMSelect Gli1、Gli2和control siRNA，TaqMan?Gli1引物和探針(Hs00171790)，Gli2引物和探針(Hs01119974_m1)，GAPDH(Hs02758991_g1)購自美國Life Technologies公司；LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑購自美國Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；iScriptTMcDNA合成試劑盒購自美國Bio- Rad公司；Pierce- BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；CyclinD1、CyclinE兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；Gli2鼠抗人單克隆抗體、GAPDH鼠抗人單克隆抗體、N- cadherin兔抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；Gli1兔抗人多克隆抗體和E- cadherin鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；Matrigel膠和Transwell膜嵌套購自美國Corning公司；ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Epics- XL型流式細胞儀購自美國Beckman- Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 SK- MES- 1細胞使用含10%胎牛血清(FCS)及青霉素/鏈霉素雙抗各10 U·ml-1的RPMI- 1640培養基培養，于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養，每隔1～2 d換液1次。細胞鋪滿培養板底面積80%～90%時進行傳代，傳代時使用0.25%胰酶溶液消化。實驗細胞選用對數生長期細胞，以每孔3×105個細胞接種于6孔板上，培養24 h后待細胞密度達到50%～60%更換無血清培養基，按照LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑說明書進行Gli1和Gli2 siRNA轉染，同時設立空白對照組(control SiRNA)。每組各設3個孔，每孔Gli1 & Gli2 siRNA及空白對照siRNA的濃度均為100 nmol·L-1。轉染6 h后更換新的無血清培養基，轉染48 h后提取各組樣本的mRNA及蛋白，實驗重復3次。

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測Gli- 1和Gli- 2基因的表達 轉染48 h后用PBS洗滌6孔板細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA，在NanoDrop 8000全光譜紫外- 可見光分光光度計檢測下對每組樣本的RNA濃度進行檢測。采用cDNA合成試劑盒進行cDNA的反轉錄，每組樣本的反應體系共為40 μl，包含總RNA500 ng，iScript逆轉錄酶2 μl和iScript反應混合液8 μl，在25 ℃ 5 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的條件下進行cDNA的反轉錄。用無R- Nase水將反轉錄的cDNA稀釋10倍，以10 μl·孔-1的反應體系(每組樣本cDNA4.5 μl，Taqman基因表達預混液5 μl，TaqMan?Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探針0.5 μl)加樣在384孔板，在ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，PCR擴增條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環。以GAPDH的CT值作為內參，采用2-ΔCt法進行各組數據分析。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達 用PBS洗滌轉染48 h后的6孔板細胞，每孔加入100 μl含有蛋白酶抑制劑的M- PER細胞總蛋白提取試劑，用刮匙收集各組樣本的總蛋白提取液后用BCA法測定各組樣本的總蛋白濃度。采用常規Western blot法蛋白上樣進行凝膠電泳和轉PVDF膜。再用5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜，加入一抗Gli1(工作濃度為1∶1 000)、一抗Gli2(工作濃度為1∶250)、一抗Cyclin D1(工作濃度為1∶1 000)、一抗Cyclin E(工作濃度為1∶1 000)、一抗E- cadherin(工作濃度為1∶8 000)、一抗GAPDH(工作濃度為1∶10 000)和一抗N- cadherin(工作濃度為1∶500)，于4 ℃搖床過夜孵育。用TBST液10 min·次-1洗膜，共3次，加入工作濃度均為1∶20 000的羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，將膜置于ECL發光，再放到暗室經X線曝光顯影，最后將顯影蛋白條帶通過Image軟件分析灰度值。以GAPDH為內參，每組樣本蛋白相對表達=目的蛋白表達量/內參蛋白表達量。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測肺鱗癌SK- MES- 1細胞周期 收集轉染48 h后的SK- MES- 1細胞，將細胞制備成單細胞懸液，用4 ℃ 70%冰乙醇固定以PBS漂洗的單細胞懸液30 min。調整每組樣品細胞數為1×106個·(0.1 ml)-1，再用冷PBS漂洗3次后加入50 μg·ml-1碘化吡啶1 ml，在4 ℃冰箱染色30 min后通過流式細胞儀檢測DNA含量，應用MuticycleAV分析軟件對DNA細胞周期進行擬合分析。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將Matrigel膠按1∶4用培養基稀釋后以50 μl包被Transwell小室基底膜，在37 ℃條件下放置2 h使Matrigel膠凝固為凝膠。分別加入Gli1 & Gli2 siRNA和Control siRNA轉染的7.5×104個細胞在上室，在下室中加入含10%胎牛血清的培養液500 μl后在5% CO2、37 ℃的培養箱內培養。24 h后常規去除上室液體，用棉簽擦去Matrigel膠和未侵襲的細胞，用甲醛固定小室基底膜，結晶紫染色，在顯微鏡(×400)下觀察。在每張膜上隨機取4個視野，計數每個視野內的穿膜細胞數的平均值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR結果

將Gli1 & Gli2 siRNA組與control siRNA組檢測數據經標準化處理后顯示：Gli1 & Gli2 siRNA組Gli1 mRNA表達水平為0.27±0.03，較control siRNA組1.00±0.03顯著降低，差異有統計學意義(t=32.24，P<0.01)；Gli2 mRNA表達水平為0.35±0.02，較control siRNA組1.00±0.03顯著降低，差異有統計學意義(t=32.96，P<0.01)，見圖1。

與control siRNA比較，aP<0.05

圖1 實時熒光定量PCR法檢測不同siRNA處理SK- MES- 1細胞的Gli1、Gli2 mRNA水平

2.2 Western blot檢測蛋白表達

SK- MES- 1細胞Gli1、Gli2、CyclinD1、Cyclin E、E- cadherin和N- cadherin蛋白表達的結果顯示，Gli1 & Gli2 siRNA組Gli1(t=14.81，P<0.001)、Gli2(t=16.29，P<0.01)、CyclinD1(t=15.61，P<0.01)、Cyclin E(t=6.74，P<0.01)和N- cadherin(t=21.62，P<0.01)表達較control siRNA顯著減少，差異有統計學意義；E- cadherin蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(t=-44.18，P<0.01)，見圖2。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期結果

流式細胞術檢測結果顯示：Gli1 & Gli2 siRNA組G0/G1期細胞為(63.22±5.66)%，與control siRNA組[(44.78±3.68)%]比較顯著增高(t=-4.73，P=0.009);S期細胞為(32.28±4.75)%，與control siRNA組[(50.13±3.50)%]比較顯著降低(t=-5.24，P=0.006)，見圖3。

與control siRNA組比較，aP<0.05

A.電泳結果; B.SK- MES- 1細胞中蛋白相對表達

圖2 Western blot法檢測SK- MES- 1細胞中Gli- 1、Gli- 2、Cyclin D1、Cyclin E、N- Cadherin和E- Cadherin蛋白表達

與control siRNA組比較，aP<0.05

圖3 流式細胞術檢測siRNA作用下SK- MES- 1細胞周期直方圖

2.4 Transwell侵襲實驗

與control siRNA組穿膜細胞數(124.67±7.50)比較，Gli1 & Gli2 siRNA組穿膜細胞數(64.33±6.51)明顯減少，差異有統計學意義(t=10.52，P<0.001)，見圖4。

3 討 論

Hedgehog(Hh)信號通路主要由Hh配體、跨膜蛋白受體Ptch、Smo、核轉錄調控子Gli以及下游靶基因等構成，當Hh配體與受體復合物結合后使Ptch內化降解，從而失去對Smo的抑制，被磷酸化激活的Smo與SUFU- Gli- Kif7復合物作用釋放出Gli蛋白，進而誘導Hh信號下游靶基因的表達。Gli1和Gli2具有轉錄激活作用，可以進入細胞核與下游靶基因啟動子區結合并調控靶基因的轉錄，進而促進細胞增殖和上皮- 間質轉化，抑制細胞凋亡，從而導致腫瘤的發生發展[7- 8]。本研究首先轉染Gli1、Gli2 siRNA進入肺鱗癌SK- MES- 1細胞中，結果顯示與空白siRNA比較，內源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達均顯著下調，表明特異性的Gli1、Gli2 siRNA能有效下調肺鱗癌細胞中內源性Gli1、Gli2的表達。

與control siRNA組比較，aP<0.05

A.鏡下結果； B.兩組間穿膜細胞數比較

圖4 Transwell實驗檢測siRNA對SK- MES- 1細胞侵襲能力的影響(×400)

細胞周期紊亂與腫瘤的發生密不可分，當細胞的增殖能力增強或對正常負性調節的刺激變弱均可導致腫瘤發生。本研究通過應用流式細胞術分析了Gli1、Gli2siRNA對SK- MES- 1細胞周期分布的影響，結果發現Gli1 & Gli2siRNA轉染組將細胞阻滯于G0/G1期，S期細胞比例顯著低于對照組，表明Gli的表達可以調控細胞周期，Gli1和Gli2表達下調可以使肺鱗癌細胞周期更多地靜止在G0/G1期從而阻斷DNA復制抑制細胞增殖。為了更進一步證實Hh/Gli通路與肺鱗癌細胞周期之間的關系，我們通過運用Western blot法對細胞周期相關蛋白Cyclin D1、Cyclin E蛋白進行了檢測，結果顯示Gli1、Gli2表達沉默后CyclinD1和CyclinE蛋白表達下調。Cyclin D1是細胞周期的關鍵因子，在正常組織中表達很低，而在許多惡性腫瘤中呈高表達，其表達可以和CDK4、CDK6形成cyclinD/CDK復合物，促進細胞由G1期進入S期，加速細胞的增殖，促進細胞癌變和進展[9- 10]。Cyclin E是調控細胞周期G1/S期的重要蛋白，其上調與結腸癌[11]、乳腺癌[12]的發展相關。本研究結果顯示Gli1和Gli2表達沉默后Cyclin D1、Cyclin E蛋白的表達下降，表明Hh/Gli信號通路激活后可能通過調節Cyclin D1和Cyclin E的表達進而調節細胞周期，這與Seiler等[10]研究發現Cyclin D1作為Hh通路的靶基因被活化的結果相符。

上皮- 間質轉化與腫瘤細胞的侵襲和轉移有著密切關系，上皮- 間質轉化是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，以上皮表型標志E- Cadherin下調、N- Cadherin和Vimentin等間質表型特征分子表達上調為特征，是腫瘤細胞獲得侵襲與轉移能力的有效方式之一[13- 14]。本研究運用Western blot法顯示抑制Gli1和Gli2表達后E- Cadherin表達上調，N- Cadherin表達下調；Transwell實驗進一步說明了沉默Gli1、Gli2表達后穿膜細胞數明顯減少，結果表明通過抑制Hh/Gli通路可以抑制肺鱗癌細胞的上皮- 間質轉化過程，進而限制了腫瘤的侵襲轉移，而Chen等[15]研究已經證實了在肝癌細胞中可以通過下調Gli1而阻止上皮- 間質轉化的過程。

本研究結果提示，Gli基因的表達下調可能通過調節Cyclin D1、Cyclin E使細胞更多的阻滯在G0/G1期，進而延緩腫瘤細胞增殖，并且Gli基因的表達下調還可以抑制上皮- 間質轉化的過程進而限制腫瘤細胞的侵襲轉移，這為以后抗腫瘤的治療提過了更多的依據。

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Effect of silencing Gli with small interfering RNA on the malignant biological behavior of lung squamous carcinoma SK- MES- 1 cells

MI Yuan1，DU Yuan- kun2，LIU Qing- yi1，LIAO Hai- jiang1，WANG Lin1，WANG Lei1

(1.DepartmentofThoracicSurgery，theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China;2.DepartmentofPeriodicalMagazine，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China)

Objective： To detect the expression of Gli in lung squamous carcinoma， and to analyze the effects of down- regulation of Gli expression on malignant biological behavior of lung squamous carcinoma SK- MES- 1 cells and to explore their molecular mechanisms. Methods： Gli1， Gli2 siRNA and control siRNA were transfected into SK- MES- 1 cells for 48 h respectively. The Gli- 1， Gli- 2 mRNA expression were detected by real time fluorescence quantitative PCR method. The protein expression of Gli- 1， Gli- 2， Cyclin D1， CyclinE， N- cadherin and E- cadherin were detected by Western blot assay. The cell cycle were observed by flow cytometry. Transwell assay was performed to detect cell invasion ability. Results： Compared with Control siRNA， Gli1 & Gli2 siRNA could significantly inhibit the Gli- 1， Gli- 2 mRNA and protein expression in SK- MES- 1 cells， which at last downregulated the CyclinD1， CyclinE， N- cadherin protein expression， and enhanced E- cadherin expression. Downregulation of Gli- 1， Gli- 2 could arrest cell cycle at G0/G1 phase and decrease cell invasion ability(P<0.01). Conclusion： Gli may play an important role in the development of lung squamous carcinoma. The downregulation of Gli expression can lead to changes in the cell cycle and invasion of lung squamous carcinoma， which may be associated with Cyclin D1， Cyclin E， N- cadherin and E- cadherin proteins．

lung squamous carcinoma; Gli; cell cycle; epithelial- mesenchymal transition

2016- 03- 21

2016- 07- 14

米源(1990-)，男，河北廊坊人，在讀碩士研究生。E- mail:394034007@qq.com

米源，杜媛鯤，劉慶熠，等.siRNA下調Gli基因表達對肺鱗癌SK- MES- 1細胞生物學行為的影響[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(6)：908- 913.

R734.2

A

1671- 6264(2016)06- 0908- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.016