肺癌細胞中NKG2D配體MICA及ULBP高表達及其在CIK介導的腫瘤細胞殺傷中的作用

殷小偉，盧緒章，毛正道，張倩，曹琦，黃燕華

(南京醫科大學附屬常州第二人民醫院 1.呼吸科，2.血液科，江蘇 常州 213161)

?

·論 著·

肺癌細胞中NKG2D配體MICA及ULBP高表達及其在CIK介導的腫瘤細胞殺傷中的作用

殷小偉1，盧緒章2，毛正道1，張倩1，曹琦1，黃燕華1

(南京醫科大學附屬常州第二人民醫院 1.呼吸科，2.血液科，江蘇 常州 213161)

目的:探索肺癌細胞中NKG2D配體的表達量及其與CIK細胞介導的腫瘤細胞毒性的關系。方法:在肺癌組織、癌旁組織及肺癌細胞株中用實時熒光定量PCR及蛋白質免疫印跡法檢測NKG2D配體的表達量。應用流式細胞儀檢測腫瘤細胞株A549和QG56表面NKG2D配體的表達情況。體外分離培養CIK細胞，比較NKG2D單克隆抗體預處理CIK細胞和無NKG2D單克隆抗體預處理CIK細胞介導的腫瘤細胞毒性。結果:NKG2D在肺癌組織及肺癌細胞株中高表達。CIK細胞對肺癌細胞株A549表現出較強的細胞毒性，但用NKG2D單克隆抗體預處理CIK細胞后可顯著降低這種作用(P<0.05)。結論:NKG2D配體在肺癌組織和肺癌細胞株中高表達。對于CIK細胞介導的肺癌細胞殺傷作用，NKG2D與其配體的相互作用至關重要。

肺癌； NKG2D配體； CIK細胞； MICA/B

肺癌是最常見的危害人類健康的惡性腫瘤之一，近年來，世界各國肺癌的發生率和死亡率均呈上升趨勢，每年約有130萬人死于肺癌[1]。近20年來，隨著對肺癌研究的深入，一些分子靶向藥物應用于臨床，在部分肺癌患者的治療方面獲得一定成效，但總體5年生存率仍然低于15%[2]。目前人們已經認識到，腫瘤的發生發展與機體免疫狀態尤其是細胞免疫密切相關，因此隨著多學科治療模式的逐步形成，免疫治療作為繼手術、化療及放療后的第4種腫瘤治療手段受到人們的廣泛關注，能否通過生物免疫的方法治療肺癌同樣值得研究。

腫瘤生物免疫治療主要是通過免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷。免疫細胞可以通過分泌細胞因子促進腫瘤細胞的凋亡，還可以通過免疫細胞表面的活化性受體識別腫瘤細胞表面相應的配體對腫瘤細胞實施殺傷[3- 5]。目前細胞因子誘導的殺傷(cytokine induced killer，CIK)細胞輸注被廣泛應用于腫瘤的治療并取得一定的臨床效果[6- 7]。CIK細胞是骨髓或者外周血來源的多克隆淋巴細胞，包括NK細胞、T細胞和NKT細胞。NKG2D的受體和配體相互作用，可以激活免疫細胞介導的殺傷作用，同時NKG2D還可以作為協同刺激分子增強T細胞受體的信號傳導，從而介導T細胞殺傷腫瘤的作用[8]。NKG2D和其相應的配體相互作用介導的免疫系統反應在調節主動免疫和特殊免疫中起重要作用，對腫瘤及病原體有重要的免疫監督作用。目前已經發現NKG2D特異的配體分子主要包括MICA/B和ULBPs兩類，是NKG2D發揮殺傷活性的主要配體[9]。本研究旨在探索肺癌細胞中NKG2D配體的表達量及其與CIK細胞介導的腫瘤細胞毒性的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

本研究獲得常州第二人民醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署書面的知情同意書。肺癌病人經常州第二人民醫院病理科確診，無其它特殊的納入及排除標準。

1.2 細胞株

肺癌細胞株A549和QG56購自中國科學院典型培養物保藏委員會(上海，中國)。用含10%胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM高糖培養基(Hyclone，USA)于37℃、5% CO2培養箱中培養細胞。

1.3 CIK細胞培養

采用密度梯度離心法分離人外周血單核細胞(PBMCs)，CIK細胞的具體培養參照本課題組發表的實驗方法[10]。PBMCs采用RPMI 1640培養基培養，加入10% 胎牛血清和1000 U·ml-1γ干擾素(IFNγ;PROSPEC，USA)。培養24 h后加入50 ng·ml-1人源 抗- CD3 單克隆抗體(武漢生物制品研究所，武漢，中國)和1000 U·ml-1重組人白細胞介素- 2(rhIL- 2;PROSPEC，USA)。細胞培養過程中每隔3 d在原培養瓶中加入配制好的新鮮培養基，連續培養3周后收集CIK細胞。

1.4 RNA提取與實時熒光定量PCR

采用Trizol(Invitrogen，USA)法提取臨床組織RNA，抽提所得RNA參照Superscript Ⅱ Reverse Transcriptase(Invitrogen，Carlsbad，CA)說明逆轉錄合成cDNA并于-20℃長期保存。根據NCBI提供基因序列，用Primer5設計引物序列，MICA正向引物5′- GAGCTCCCAGCATTCTACTAC- 3′，MICA反向引物 5′- GGTGTCGTGGCTCAAAGATA- 3′；ULBP2正向引物 5′- GAGAGGTGGTGGACATACTTAC- 3′，ULBP2反向引物5′- CAAGCCATCCTATACAGTCTCC- 3′;GAPDH 正向引物5′- CTATTCGATGCCGTGTATGC- 3′，GAPDH反向引物5′- GCCTGGTCCAGACTTCTTTC- 3′。引物序列送由上海生工生物工程股份有限公司(上海，中國)合成。

1.5 Western- blot檢測組織中相關蛋白表達

提取肺癌及癌旁組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。運用10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳分離蛋白，PVDF膜轉膜后5%脫脂牛奶封閉。用含一抗MICA(1∶500;Abcam Inc，USA)，β- actin(1∶10000;Cell Signaling Inc，USA) 稀釋液于4℃孵育過夜。用TBST洗滌膜5次，用含羊抗兔二抗(1∶6000;Santa Cruz Biotechnology，USA) 和羊抗鼠二抗(1∶10000;Santa Cruz Biotechnology，USA)稀釋液室溫孵育2h。應用ECL化學發光顯色，Image J進行灰度值分析，以β- actin為內參進行灰度分析。

1.6 細胞毒性實驗

A549和QG56細胞株分別與0.1μmol·L-1CAM(Calcein Acetoxymethyl Ester，Sigma Aldrich，USA)于37℃下避光共孵育15 min，然后用含10%胎牛血清的培養基洗兩遍。含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，按照一定比例種植于96孔板中。按照Effector- To- Target比(E∶T)為10的比例添加CIK細胞，終體積為 200μl。共培養細胞體系于37℃避光孵育10h，PBS洗滌細胞5次，用100μl結合緩沖液(10mmol·L-1HEPES/NaOH，140mmol·L-1NaCl，2.5mmol·L-1CaCl2，pH7.4)重懸細胞，加入10μl 7- Amino- actinomycin D(7- AAD;Molecular Probes，USA)混勻。室溫避光孵育10 min后用流式細胞儀進行分析。CIK對靶細胞的殺傷作用用特異性裂解率來表示，計算公式為：特異性裂解率=(CT- TE/CT)×100%，CT為無CIK細胞時的活靶細胞百分比，TE為CIK細胞與靶細胞共孵育后的活細胞百分比。在NKG2D阻滯實驗中，CIK細胞與10μg·ml-1抗- NKG2D抗體37℃共孵育30 min后將其加入靶細胞中。

1.7 流式細胞術檢測細胞株中NKG2D配體表達

收集細胞，MICA/B(Clone 6D4，eBioscience，USA) 和ULBP1，ULBP3和ULBP2(R&D Systems，USA)分別與細胞共孵育30 min，流式細胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)檢測細胞株NKG2D配體表達。結果采用 FlowJo 軟件(Tri Star，Inc.，Ashland，USA)進行分析。

1.8 統計學處理

所有實驗重復至少3次，應用SPSS 17.0進行統計分析。數據用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NKG2D配體在癌組織中高表達

采用qRT- PCR檢測NKG2D配體在24例肺癌組織及5例正常組織中的表達，結果顯示，與正常組相比NKG2D配體MICA和ULBP2在肺癌組織中顯著高表達，平均上調倍數為5.5(P<0.05，圖1A)。同時Western- blot檢測肺癌組織及正常組織中MICA蛋白表達，與正常組相比，肺癌組織中MICA蛋白表達顯著上調，平均上調倍數為3.5(P<0.05，圖1B、C)。

A. 肺癌組與正常組NKG2D配體相對表達量

B. 蛋白質免疫印跡法檢測MICA蛋白表達

C. 肺癌組與正常組MICA蛋白相對表達量

與正常組比較，aP<0.05

圖1 NKG2D配體MICA和ULBP2在肺癌組織及正常組織中的蛋白和基因表達

2.2 NKG2D配體在肺癌細胞株中的表達

培養肺癌細胞株A549和QG56，流式細胞術分別檢測細胞表面NKG2D配體表達。肺癌細胞株A549和QG56中均表達NKG2D和HLA Ⅰ類分子，且MICA分子在A549細胞株中的表達量較QG56高(圖2、表1)。

圖2 NKG2D配體在肺癌細胞株中的表達

表1 肺癌細胞株中NKG2D配體表達 MFI

細胞株NKG2D配體MICAULBP1ULBP2ULBP3QG561212.59.084.42A5493152.39.584.09

MFI:平均熒光密度;MICA:MHC- Ⅰ related molecules A;ULBP2，3：UL16- binding protein 2，3;自定義MFI值小于10為陰性不表達

2.3 ULBP2及MICA在A549和QG56中差異表達

培養肺癌細胞株，采用qRT- PCR檢測NKG2D配體的表達。結果顯示A549細胞株中MICA的mRNA表達量顯著高于QG56，而ULBP2在兩細胞株中的表達無顯著差異(圖3)。

2.4 NKG2D與CIK介導的肺癌細胞溶解相關

CIK細胞對A549表現出較強的細胞殺傷作用，細胞殺傷率達60%。但是NKG2D單克隆抗體預處理CIK細胞后，CIK細胞的這種殺傷作用顯著降低，殺傷率僅達30%(P<0.05，圖4)。

3 討 論

NKG2D配體在正常機體組織中很少表達，但是在毒物刺激、感染、腫瘤惡性轉化等條件下誘導表達[11]。本研究發現，相比于癌旁組織，肺癌組織中NKG2D配體的表達量顯著升高。NKG2D配體廣泛表達于腫瘤細胞膜上。有證據表明，在多種腫瘤細胞中，NKG2D能觸發免疫細胞介導的細胞毒性作用[12- 13]，但NKG2D介導的細胞毒性作用除了需要免疫細胞表達NKG2D受體外，還需要靶細胞(腫瘤細胞)表達NKG2D配體[14]。

與A549細胞株比較，aP<0.05

圖3 MICA和ULBP2在肺癌細胞株中基因表達差異

圖4 NKG2D在CIK介導的肺癌細胞溶解中的作用

CIK細胞是骨髓或者外周血來源的多克隆淋巴細胞，包括NK細胞、T細胞和NKT細胞。NKG2D是一種表達在免疫效應細胞表面的活化性受體，主要表達在NK細胞、γδT細胞及NKT細胞[15]。我們前期運用流式細胞儀檢測發現大多數(86.32%±4.75%)培養的CIK 細胞表達 NKG2D受體[16]。研究表明NKG2D配體決定了免疫細胞的不同作用效果[14]。本研究發現NKG2D配體表達于肺癌細胞株 A549細胞表面。此外，病人肺癌組織中NKG2D配體和UBP2高表達可能在腫瘤細胞被免疫細胞識別中發揮了重要作用。體外實驗表明,CIK對A549細胞具有較強的細胞毒性作用，但這種作用可以被NKG2D抗體部分阻斷。這些研究結果提示，NKG2D與其配體的相互作用在CIK細胞對肺癌細胞的識別和殺傷過程中起到了非常重要的作用。

綜上所述，本研究證實NKG2D配體在肺癌組織和肺癌細胞株中高表達。對于CIK細胞介導的肺癌細胞殺傷作用，NKG2D與其配體的相互作用至關重要。

[1] JEMAL A，SIEGEL R，WARD E，et al.Cancer statistics，2009[J].CA Cancer J Clin，2009，59(4):225- 249．

[2] YOULDEN D R，CRAMB S M，BAADE P D.The international epidemiology of lung cancer:geographical distribution and secular trends[J].J Thorac Oncol，2008，3(8):819- 831．

[3] LJUNGGREN H G，MALMBERG K J.Prospects for the use of NK cells in immunotherapy of human cancer[J].Nat Rev Immunol，2007，7(5):329- 339．

[4] 蔡楓，何貞月，姜婷婷，等.腫瘤微環境中的樹突狀細胞及其在腫瘤治療中的作用[J].東南大學學報:醫學版，2012，31(2):225- 229．

[5] 李紅英，王蓉，汪蕾.沉默microRNA- 20a對乳腺癌MCF7細胞表達NK細胞活化性受體配體MICA的研究[J].現代醫學，2014，42(1):22- 25．

[6] LINN Y C，LAU L C，HUI K M.Generation of cytokine- induced killer cells from leukaemic samples withinvitrocytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blasts[J].Br J Haematol，2002，116(1):78- 86．

[7] HONTSCHA C，BORCK Y，ZHOU H，et al.Clinical trials on CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC)[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，137(2):305- 310．

[8] MORETTA A，BOTTINO C，VITALE M，et al.Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell- mediated cytolysis[J].Annu Rev Immunol，2001，19：197- 223．

[9] EAGLE R A，TROWSDALE J.Promiscuity and the single receptor:NKG2D[J].Nat Rev Immunol，2007，7(9):737- 744．

[10] LINN Y C，LAU S K，LIU B H，et al.Characterization of the recognition and functional heterogeneity exhibited by cytokine- induced killer cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell[J].Immunology，2009，126(3):423- 435．

[11] WANG Q J，HANADA K，YANG J C.Characterization of a novel nonclassical T cell clone with broad reactivity against human renal cell carcinomas[J].J Immunol，2008，181(6):3769- 3776．

[12] ZAFIROVA B，WENSVEEN F M，GULIN M，et al.Regulation of immune cell function and differentiation by the NKG2D receptor[J].Cell Mol Life Sci，2011，68(21):3519- 3529．

[13] CHAMPSAUR M，LANIER L L.Effect of NKG2D ligand expression on host immune responses[J].Immunol Rev，2010，235(1):267- 285.

[14] FUERTES M B，GIRART M V，MOLINERO L L，et al.Intracellular retention of the NKG2D ligand MHC class I chain- related gene A in human melanomas confers immune privilege and prevents NK cell- mediated cytotoxicity[J].J Immunol，2008，180(7):4606- 4614．

[15] OGASAWARA K，LANIER L L.NKG2D in NK and T cell- mediated immunity[J].J Clin Immunol，2005，25(6):534- 540．

[16] 何金媛，賈祝霞，蔡曉輝，等.NKG2D 在細胞因子誘導的殺傷性細胞(CIK)抗血液腫瘤細胞的作用[J].中國實驗血液學雜志，2013，21(6):1380- 1384．

High expression level of NKG2D ligands MICA and ULBP in lung cancer cell and the role in CIK mediated cytotoxicity

YIN Xiao- wei1，LU Xu- zhang2，MAO Zheng- dao1，ZHANG Qian1，CAO Qi1，HUANG Yan- hua1

(1.DepartmentofRespiratory， 2.DepartmentofHematology，ChangzhouNo.2People’sHospital，theAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Changzhou213161，China)

Objective： To identify the expression level of NKG2D ligands in lung cancer cell and the interaction between NKG2D and NKG2D ligands in the CIK mediated cytotoxicity against tumor cells. Methods: We used RT- PCR and Western- blot to detect the expression level of NKG2D ligands in lung cancer tissue，para- carcinoma tissues and cell lines.The expression of NKG2D ligands in the surface of lung cancer cell lines was determined by flow cytometry.CIK cells were isolated and culturedinvitro.The anti- NKG2D mAbs treated CIK and non- anti- NKG2D mAbs treated CIK cells mediating cytotoxicity against A549 was determined by flow cytometry also. Results: NKG2D ligands highly expressed in lung cancer cells.The CIK cells caused cytolysis against the A549，but this cytolysis was decreased(30%±3.2%) by pretreatment of CIK cells with anti- NKG2D mAbs. Conclusion: The present study demonstrates the higher expression level of NKG2D ligands in lung cancer tissue than para- carcinoma tissue.The killing effect of lung cancer cells by CIK cell is partially mediated by NKG2D- NKG2D ligand interaction.The interaction between NKG2D and NKG2D ligands play a vital role in the CIK mediated tumor cell killing.

lung cancer; NKG2D ligands; CIK cells; MICA/B

2016- 05- 12

2016- 09- 01

南京醫科大學重點醫學項目(2012NJMU126)

殷小偉(1969-)，男，江蘇常州人，主任醫師。E- mail：xiaoweiyinhuxi@163.com

盧緒章 E- mail：luxuzhang2008@163.com

殷小偉，盧緒章，毛正道，等.肺癌細胞中NKG2D配體MICA及ULBP高表達及其在CIK介導的腫瘤細胞殺傷中的作用[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(6)：861- 865.

R734.2

A

1671- 6264(2016)06- 0861- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.007