GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A在親子鑒定中的應用

練勇伶，邱平明，陳玲

（南方醫科大學 法醫學院，南方醫科大學司法鑒定中心，廣東 廣州510515）

GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A在親子鑒定中的應用

練勇伶，邱平明，陳玲

（南方醫科大學 法醫學院，南方醫科大學司法鑒定中心，廣東 廣州510515）

目的 探討GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A試劑盒在親子鑒定中的應用價值。方法 對738例親子鑒定的1 680份樣本，采用Goldeneye 25A試劑盒復合擴增23個常染色體STR基因座和1個Y-STR基因座，評估該系統在親子鑒定中的排除能力和突變率。 結果采用Goldeneye 25A系統，累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。738例親子鑒定案例中排除親子關系63例，最常見為9～13個基因座排除；等位基因突變事件22例，其中一步突變21例，二步突變1例，20例表現為1個STR基因座突變，1例表現為2個STR基因座突變；D19S253與FGA基因座的突變率最高，均為5.42×10-3，父系突變與母系突變比例為6.33∶1。Y-STR與Amelogenin基因座的分型結果相符。結論Goldeneye 25A系統用于親子鑒定是高效的。

法醫遺傳學；STR；親子鑒定；GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A

GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A試劑盒（簡稱Goldeneye 25A）是北京基點認知技術有限公司2015年末推出的一個五色熒光STR復合擴增系統。該系統在GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統20試劑盒的基礎上，增加了4個常染色體STR基因座（D22S1045、 D1S1656、D10S1248、D2S441）和1個Y染色體STR基因座（DYS391）。本研究對該系統在738例親子鑒定中的應用情況進行了分析，評估該系統在親子鑒定應用中的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

本鑒定中心2016年1月—2016年5月受理的738例親子鑒定案件，共1680份樣本，包括血痕、血液、毛發、羊水、口腔拭子、肌肉等。738例中，三聯體331例，父子二聯體244例，母子二聯體163例，均知情同意。

1.2 儀器

3500xl遺傳分析儀（美國AB公司）。

1.3 方法

除血痕、口腔拭子采用直擴法，其余樣品均采用Chelex-100法[1]提取DNA。 采用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統25A試劑盒復合擴增。PCR反應體系為10 μL，其中含去離子水6 μL、5×PCR反應預混液Ⅳ2μL、5×25A引物混合物2μL、模板為1mm2血痕/口腔拭子或1μL DNA提取液。熱循環條件為：95℃2min；94℃5s，60℃1min，循環30次；60℃10min，15℃保溫，最終擴增產物于4℃保存。GeneMapper IDX軟件分析結果。

1.4 數據分析

累積非父排除率（CPE）參照文獻[2]進行計算。對每例案件計算累積親權指數（CPI）[3]。根據親權鑒定技術規范[4]，3個以上的基因座不符合遺傳規律，則排除父權關系的存在；CPI≥10000，則支持親權關系的存在；有1~2個基因座不符合遺傳規律，可以考慮為基因突變；將與子代新等位基因相差最小的親代基因視為突變基因，該親代視為突變基因的提供者，以確定突變基因的父/母來源[5]。

2 結果

2.1 Goldeneye 25A在親子鑒定中的應用

本系統累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。

用Goldeneye 25A系統檢測738例親子鑒定案件，331例三聯體案例中認定316例，排除15例，407例二聯體案例中認定359例，排除48例（表1）；排除基因座最少4個，多為9～15個基因座，排除概率較高的基因座為Penta E、D18S51和FGA（表2）。Goldeneye 25A認定親子關系的三聯體案例，CPI小于10000的占0.949%（3/316），其中2例小于10 000是因為發生突變。Goldeneye 25A認定親子關系的二聯體案例，CPI小于10 000的占1.114%（4/359），均有突變發生。

表1 738例親子鑒定的排除情況

表2 各基因座排除情況

2.2 STR突變

Goldeneye 25A系統肯定親子關系的675例案件中共發現等位基因突變事件22例，20例表現為1個STR基因座突變，1例表現為D19S253與FGA這2個STR基因座均突變；21例為一步突變，1例為二步突變、發生在Penta E基因座。各基因座突變率（表3），其中D19S253與FGA突變率最高；父系突變19例，母系突變3例，父系突變與母系突變的比例為6.33∶1，總的突變率小于0.2%。

表3 各基因座突變率

2.3 三等位基因現象

Goldeneye 25A系統否定親子關系的63例中發現2例罕見的基因變異，其中1例Penta D基因座上孩子基因型為（9，13，14），峰高比約為1∶1∶1（圖1），疑父基因型為（8，12）。

圖1 Goldeneye 25A系統和PowerPlex21系統在Penta D基因座的分型圖譜

2.4 無效等位基因

用Goldeneye 25A系統檢測的738例親子鑒定案件中，1例親子鑒定經Goldeneye 25A系統檢測，父和子在Penta E基因座均表現為純合子、且峰高和附近雜合子基因座的峰高接近，經PowerPlex21系統檢測證實Goldeneye 25A系統在Penta E基因座出現等位基因丟失，父基因型為（14，19），子基因型為（18，19）（圖2）。

圖2 Goldeneye 25A系統和PowerPlex21系統檢測一例案件在Penta E基因座的分型圖譜

3 討論

3.1 親子鑒定系統的效能分析

Goldeneye 25A系統的累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999，高于Goldeneye 20A試劑盒[6]，表明該系統對于親子鑒定有更高的效力。

Goldeneye 20A系統中DNA變性-復性-延伸循環進行[7]。Goldeneye 25A系統因復性與延伸溫度一致，均為60℃，在引物結合模板DNA的同時進行DNA延伸。Goldeneye 20A直接擴增需2 h 50 min；提取后擴增需2h 30min。Goldeneye 25A系統擴增只需50多分鐘，所以Goldeneye 25A系統更省檢測時間。

3.2 STR基因座的突變和變異分析

Goldeneye 25A系統認定的675例親子鑒定中，有12個STR基因座檢出突變，突變率最高的基因座是D19S253與FGA，本研究觀察到1宗案件在D19S253與FGA兩個基因座均發生突變。FGA在本中心大群體樣本的研究中也顯示該基因座是高突變率基因座。足夠大數量的群體樣本才可獲得比較接近的突變率數據。因此突變率數據要參考大群體樣本的研究。目前尚無D19S253在大群體樣本中的突變率數據，但本研究顯示該基因座可能為高突變基因座，這有待后續親子案件的積累和進一步觀察。而

D13S317、TPOX、D7S820、D1S1656、D8S1179、D5S818、CSF1P0、D3S1358、vWA、D2S441、TH01等基因座未觀察到突變事件，與本研究案件數量少有關。本研究觀察的減數分裂次數男女比例為1.50∶1，父系突變與母系突變比例為6.33∶1，男性精母細胞成熟所需的分裂次數比女性配子成熟的分裂次數多，父系突變率較高，與既往文獻報道相似[8]。

2例三等位基因的個體，分別采用不同的試劑盒進行PCR擴增，其結果一致，說明檢出的2例個體三帶型等位基因不是污染或泳道滲漏造成的假象，也不是PCR擴增引起的非特異性產物[9]。Penta D表現為三帶的案例，其D21S11基因座分型結果為29/31、其中等位基因31的峰高約為等位基因29峰高的2倍，追溯案情確認為21三體綜合征。CSF1PO為表現為三帶的案例，其D5S818基因座表現正常，排除染色體數量異常；因峰高較低的兩個等位基因僅相差一個核心重復序列，推測可能是原本為雜合子的兩個等位基因在個體發育過程中，其中的一個等位基因發生了一步滑動錯配，從而產生新的等位基因[10]。

Goldeneye 25A系統檢測時發現1例親子鑒定在Penta E基因座出現等位基因丟失。DNA圖譜顯示該基因座的峰高與附近雜合子基因座的峰高接近，且僅該基因座違反遺傳規律，初步預測可能是等位基因丟失，加做PowerPlex21系統檢測，確認用Goldeneye 25A檢測時在Penta E基因座出現等位基因丟失。目前常使用不同的試劑盒檢測或測序來確定是否出現等位基因丟失（無效等位基因）[11]。

近年因入戶等需求，親子鑒定案件量劇增，選擇高效的檢測系統非常必要。與Goldeneye 20A系統相比，Goldeneye 25A系統檢測可獲得更多基因座的分型結果，系統效能也優于Goldeneye 20A系統。然而，對于該系統影響親子鑒定結果判定的STR基因座突變、三帶型、等位基因丟失等問題仍需注意，必要時需增加其他檢測手段復核，以保證鑒定結果的準確性。

[1][美]John M Butler.法醫DNA分型專論[M].第3版.侯一平，李成濤，譯.北京：科學出版社，2013：83-117.

[2]侯一平.法醫物證學[M].北京：人民衛生出版社，2009：21-23.

[3]GA/T 965-2011，法庭科學DNA親子鑒定技術規范[S].2011.

[4]SF/Z JD0105001-2010，親權鑒定技術規范[S].2010.

[5]呂德堅，陸惠玲.DNA親權鑒定[M].廣東：暨南大學出版社，2005：99，108-113.

[6]王潔，焦章平，黃艷梅，等.國產試劑盒GoldeneyeTM20A在親權鑒定中的應用評估[J].中國法醫學雜志，2012，27（3）：205-208.

[7]周保成，許天龍，毛華芬，等.19個STR基因座分型在 741例親子鑒定中的應用[J].中國法醫學雜志，2015，30（4）：396-398.

[8]陳玲，劉超，邱平明，等 STRtyper-10G系統9個STR基因座突變分析[J].中國法醫學雜志，2014，29（5）：420-423.

[9]陳芳，陳儉，付穎，等.STR基因座中檢出三帶型等位基因7例[J].法醫學雜志，2014，30（3）：215-216.

[10]陳玲，劉超，邱平明，等.常染色體STR基因座三帶型的觀察與分析[J].中國法醫學雜志，2014，29（4）：316-318.

[11]Ling Chen，Yunchun Tai，Pingming Qiu，et al.A Silent Allele in the Locus D5S818 Contained Within the Power-Plex 21 PCR Amplification Kit[J].Legal Medicine，2015，17（6）：509–511.

（本文編輯：李成濤）

Application of GoldeneyeTMDNA ID System 25A Kit in Paternity Testing

LIAN Yong-ling，QIU Ping-ming，CHEN Ling
（Department of Forensic Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To assess the feasability of applying GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit in paternity test cases.Method 23 autosomal STR loci and 1 Y-STR locus of 1680 samples from 738 cases were amplified with Goldeneye 25A kit to validate its exclusion power and mutation rate.Results The cumulated chance of exclusion and the cumulated discriminating power of Goldeneye 25A were greater than 0.999，999，999，999，999，999，999，999，999，999.63 out of 738 cases were excluded，most of which had 9-13 exclusion loci.22 mutation events were observed.Among them，21 mutations were one step and 1 mutation was two steps;20 cases showed single-locus mutation and 1 case showed two-loci mutation.D19S253 and FGA had the highest mutation rate of 5.42×10-3.The ratio of paternal mutation versus maternal mutation was 6.33∶1.The genotype results of Y-STR were consistent with those of Amelogenin.Conclusion Goldeneye 25A is highly effective for paternity testing.

forensic genetics;STR;paternity testing;GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2016.06.004

1671-2072-（2016）06-0018-05

2016-06-30

練勇伶（1994—），女，碩士研究生，主要從事分子遺傳學研究。E-mail：416585484@qq.com。

陳玲（1980—），女，副主任法醫師，博士，主要從事法醫物證學研究。E-mail：lingpzy@163.com。