高效液相色譜法測定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧，戴群芳，汪保林

（1．江西省南昌市洪都中醫院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

高效液相色譜法測定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧1，戴群芳2，汪保林2

（1．江西省南昌市洪都中醫院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

目的 建立測定三花膏中蒙花苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 以三花膏中野菊花藥材中的主要活性成分蒙花苷為對照品，采用Phenomenex Luna C18反相色譜柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)，以甲醇(A)－含10 mmol／L H3PO4的水溶液(B，48∶52)為流動相進行等度洗脫，流速為1．0 mL／min，檢測波長為334 nm，柱溫為35℃。結果 蒙花苷質量濃度在4．67～46．74 g／L范圍內與峰面積線性關系良好（r＝0．999 9，n＝5），加樣回收率為99．75%，RSD為1．80%（n＝6）。結論 該方法簡便、準確，專屬性強，適用于三花膏中蒙花苷的含量測定。

高效液相色譜法；三花膏；蒙花苷；含量測定

三花膏是南昌市洪都中醫院自制制劑（批準文號為贛藥制字Z20090089），由木芙蓉花、野菊花、金銀花3味藥組方。全方具有清熱解毒、軟堅散結之功效，主治癰疽疔癤、乳癰、以及無名腫毒，臨床應用療效顯著。野菊花為菊科 Compositae植物野菊 Chrysanthemum indicum L．的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、瀉火平肝之功效，多用于疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈等癥[1]。其含有木犀草苷、綠原酸、蒙花苷、尿嘧啶、槲皮素、丁香脂素、鵝掌楸堿、麥黃酮、β－谷甾醇、α－香樹脂醇、β－香樹脂醇、羽扇豆醇、金合歡素、香草酸等多種化學成分[2－5]。野菊花為本制劑的主藥之一，而蒙花苷為野菊花藥材的重要活性成分。文獻[6－8]報道蒙花苷的含量測定多采用高效液相色譜(HPLC)法。為了有效控制該醫院制劑的質量，參照2015年版《中國藥典（一部）》中藥材野菊花的HPLC測定方法并結合文獻[9]，以蒙花苷為檢測指標，建立了測定本品中蒙花苷含量的HPLC法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Shimadzu LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BS224 S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Mettler Toledo XS105 DualRange型電子天平(Mettler Toledo公司)；UV－2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；KQ－300DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

蒙花苷對照品（批號為111528－200606，中國食品藥品檢定研究院，含量為98．3%）；三花膏（洪都中醫院制劑中心，批號分別為20160420，20160519，20160515）；甲醇為色譜純（Merck公司）；水為超純水（Purifier DZG－303A超純水系統，博科公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex Luna C18反相色譜柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)－含10 mmol／L磷酸的水溶液(B，48∶52)；流速：1 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：334 nm；進樣量：10 μL。理論板數按蒙花苷計應不低于10 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。供試品蒙花苷峰保留時間為17．8 min。陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間無吸收峰，表明對含量測定無干擾。

2．2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取蒙花苷對照品適量，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成質量濃度為77.4 μg/mL的溶液，即得對照品貯備液。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：取缺野菊花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得缺野菊花的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

供試品溶液提取方法考察：選擇以測定供試品中蒙花苷的含量為指標，對提取溶劑（因素A）和超聲時間（因素B）進行正交試驗設計。因素水平見表1，結果見表2。按直觀分析，影響含量測定結果的因素為A＞B，最佳提取工藝為 A2B3，故擬選擇 A2B3，即供試品以70%甲醇超聲處理45 min。由于3種超聲時間中含量測定結果基本一致，因此在不影響試驗準確性的前提下，綜合考慮到時間、成本效益，最終選擇超聲30 min作為提取條件。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9（32）正交試驗考察結果

線性關系考察：取2.2項下對照品溶液作為1號對照品溶液，分別精密量取0.5，1.0，1.5，3.0，5.0 mL，置10 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得2號、3號、4號、5號、6號對照品溶液。按擬訂色譜條件分別取10 μL進樣測定，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=2.215 64×107X+4 918.75，r=0.999 9。結果質量濃度在4.67～46.74 g/L范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限測定：精密稱取蒙花苷對照品適量，將2.2項下制得的對照品溶液用甲醇逐級稀釋，取10 μL進樣測定，按3倍信噪比計算化合物的檢測限。結果檢測限為0.54 ng。

精密度試驗：取4號對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次，測定各化合物的峰面積。結果的 RSD為0.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時進樣，測定峰面積。結果的 RSD為1.0%（n=7），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批三花膏樣品6份，每份約2.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液并進樣測定含量。結果蒙花苷的平均含量為 0.62 mg/g，RSD為0.5%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量（蒙花苷含量為0.62 mg/g）的三花膏樣品6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別置已加標并經氮氣吹干的6個錐形瓶中（90 μg/mL的蒙花苷對照品溶液各15 mL），依法制備供試品溶液。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算含量及回收率。結果見表3。

表3 蒙花苷加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取9批三花膏樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，每份樣品測3次，以外標法計算各指標成分含量。結果見表4。

表4 三花膏中蒙花苷含量測定結果

3 討論

3.1 指標成分選擇

綠原酸、木犀草苷等也是野菊花的主要活性成分［2］，但易與三花膏處方中的金銀花藥材所含活性成分形成干擾，因此本研究中最終選擇具有廣泛藥理活性，化學性質穩定，且能被準確、靈敏測定的蒙花苷作為三花膏含量控制標準。

3.2 測定波長選擇

取蒙花苷對照品適量，用水（10 mmol/L磷酸）-甲醇（52∶48）溶液配制成質量濃度為1.0 g/L的對照品溶液，在190～600 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，測得蒙花苷在334 nm波長處有較大吸收。

3.3 流動相篩選

考察了2015年版《中國藥典（一部）》野菊花蒙花苷含量測定項下的流動相甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）［1］、乙腈-甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫［9］及水（10 mmol/L H3PO4）-甲醇（32∶48），結果，后者洗脫效果較理想，故選擇后者為流動相。

3.4 提取方法考察

考察了不同濃度的甲醇溶液與不同提取時間對蒙花苷提取效果的影響，結果表明，70%的甲醇超聲30 min的效果較理想，提取充分且效果十分穩定；先用石油醚進行提取，繼而棄去石油醚提取液，然后再采用不同濃度的甲醇進行超聲提取，結果發現，回收率明顯低于單一的超聲提取方法。故選擇70%甲醇超聲處理30 min。

3.5 對照品溶液制備

蒙花苷對照品易溶于熱的甲醇溶液中，在制備對照品溶液的過程中，需仔細觀察，確保其充分溶解，必要時可采用加熱的方法促使其溶解，冷卻至室溫后再定容至刻度。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：314-315.

［2］馮子明，楊椏楠，姜建雙，等.野菊花的化學成分［J］.中國中藥雜志，2010，35（24）：3 302-3 305.

［3］王錦越，陳 東，梁麗娟，等.野菊花的化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（6）：718-721.

［4］畢躍峰，潘成學，王普菊，等.野菊花的化學成分研究［J］.中國藥學雜志，2009，44（12）：894-897.

［5］高美華，李 華，張 莉.野菊花化學成分的研究［J］.中藥材，2008，31（5）：682-684.

［6］譚曉杰，賈 英，陳曉輝，等.RP-HPLC法測定野菊花中蒙花苷含量［J］.沈陽藥科大學學報，2004，21（6）：434-435.

［7］崔蘭沖，李小芩，韓 瑩，等.HPLC測定野菊花中蒙花苷與木犀草素的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32（1）：33-35.

［8］郭美蘭，敬應春，蔡國琴.RP-HPLC同時測定野菊花中綠原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量［J］.中國現代中藥，2012，14（4）：10-13.

［9］孫 菲，孫 欣，金 榮.高效液相色譜法測定香菊膠囊中蒙花苷含量［J］.中國藥業，2016，25（8）：72-74.

Content Determination of Linarin in Sanhua Ointments by HPLC

Qiu Hui1,Dai Qunfang2,Wang Baolin2
(1．Nanchang Hongdou Hospital of TCM,Nanchang,Jiangxi,China 330000; 2．Nanchang Institute for Food and Drug Control,Nanchang,Jiangxi,China 330038)

Objective To develop an HPLC method for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．Methods Linarin, which was the main active ingredient of Flos Chrysanthemi Indici in Sanhua Ointments,was used as the reference standard．The isolation was performed on a Phenomenex Luna C18reversed phase column(250 mm× 4．6 mm,5 μm)with the mobile phase consisting of methanol－water(containing 10 mmol／L H3PO4)(48∶52),isocratic elution;the flow rate was 1．0 mL／min,the detection wavelength was 334 nm and the column temperature was set at 35℃．Results The linearity of linarin was good in the range of 4．67－46．74 g／L (r＝0．999 9,n＝5),the average recovery rate was 99．75% and RSD was 1．80%（n＝6）．Conclusion This method is simple,accurate, and specific for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．

HPLC;Sanhua Ointments;linarin;content determination

邱慧，碩士研究生，藥師，研究方向為藥物分析，（電子信箱）412672105@qq.com；汪保林，碩士研究生，研究方向為藥物分析，本文通訊作者，（電話）0791-88538260（電子信箱）rlxlei1021@163.com。

2016－04－22；

2016－06－01）

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)19－0061－03