丙泊酚對LPS激活人體中性粒細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子的影響及機制研究

彭 生 汪 偉 李 煒 董 楠

1.江蘇省無錫市第四人民醫(yī)院麻醉科，江蘇無錫 214062；2.江蘇省血吸蟲病防治研究所，江蘇無錫 214064

中性粒細(xì)胞（PMN）是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。PMN激活后可以釋放大量炎性細(xì)胞因子，炎性細(xì)胞因子又可延遲PMN凋亡，造成更多炎性細(xì)胞因子的釋放。而過量的炎性細(xì)胞因子是ARDS及MODS發(fā)病的重要因素。因此阻斷PMN的激活及其下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄具有重要意義。丙泊酚是常用的靜脈全麻藥，在體動物研究顯示其可以抑制PMN激活，減少炎性細(xì)胞因子的釋放[1]。而對于人體PMN的作用研究報道較少。本文擬離體研究丙泊酚對激活狀態(tài)下人體PMN釋放細(xì)胞因子的變化，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

丙泊酚（阿斯利康公司贈予）；內(nèi)毒素（E．ColiO55：B5，sigma公司，美國）；中性粒細(xì)胞分離液，淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物公司）；p65 antibody（Santa Cruz Inc.，美國）；TNF-a、IL-8 檢測試劑盒（CST，Inc.，美國）。

1.2 PMN分離

20例健康志愿者，均經(jīng)知情同意，確認(rèn)沒有血液病、免疫性疾病、慢性炎癥、發(fā)熱等情況，近期無手術(shù)、麻醉史，未服用過抗炎藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物，無長期使用鎮(zhèn)靜藥物的病史。年齡 21～28 歲，平均（24±3）歲，男女比例為 8/12，每人采取外周靜脈血20 mL，加入20 U/mL肝素抗凝。1 200r/min，離心10 min，棄血漿層；加入淋巴細(xì)胞分離液后離心（2 000 r/min，20 min），棄單核細(xì)胞層、分離液層；剩余白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層中加入9 倍體積 0℃的 NH4Cl液（Cl：155 mmol/L，KHCO3：10 mmol/L，EDTA：0.1 mmol/L）充分均勻后0℃下靜置7 min，再次離心（1 500 r/min，10 min），然后用 0.9%的生理鹽水洗滌 2次，以RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×107/mL。瑞氏染色證實其純度＞95%，苔盼藍(lán)排斥試驗檢測，活細(xì)胞＞98%。分組每例分離好的PMN分成5部分，分別置入培養(yǎng)板中，分別加入等量生理鹽水（C組，對照組）、LPS組（終濃度為100ng/L）、LPS+丙泊酚 2μg/mL組（P1組）、LPS+丙泊酚 4 μg/mL 組（P2組）、LPS+丙泊酚8μg/mL組（P3組）。置入CO2培養(yǎng)箱中孵育（37℃，濕度 100%，5%的 CO2和 59%的空氣）12 h。

分離PMN所用器具均經(jīng)無熱源處理，玻璃器皿經(jīng)高壓蒸汽消毒后，烘箱內(nèi)200℃干烘2 h，塑料器具經(jīng)高壓蒸汽消毒后，90℃干烘 7 d。

1.3 檢測指標(biāo)

12 h后分離細(xì)胞，Western blotting方法檢測核內(nèi)p65含量；同時取細(xì)胞分離后的上清液，ELISA法檢測TNF-α、IL-8表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對LPS激活PMN釋放炎性細(xì)胞因子的影響

PMN培養(yǎng)12 h后，上清液中TNF-α、IL-8含量在LPS組顯著高于C組（P＜0.01）；加入不同濃度丙泊酚的P1、P2、P3組較LPS組均顯著減少（P＜0.05、0.01），且具有劑量依賴性。見表1。

表1 中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-8含量（x±s）

2.2 丙泊酚對PMN核內(nèi)p65含量的影響

相對于C組，LPS組p65含量顯著增加（P＜0.01）；加入丙泊酚的 P1、P2、P3組較 LPS組均顯著減少 （P＜0.05、0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性。見表2。

表2 丙泊酚對中性粒細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白含量的影響（x±s，n=20）

3 討論

丙泊酚是臨床常用的全身麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗炎作用[2]。筆者前期在體研究也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以通過抑制大鼠中性粒細(xì)胞NK-κB亞基p65的激活，減輕內(nèi)毒素休克大鼠炎癥反應(yīng)[3]。對人體中性粒細(xì)胞是否也有同樣的作用，目前尚少見報道。

本研究采用人體PMN離體培養(yǎng)，一方面排除在體研究過程中機體各系統(tǒng)之間相互作用產(chǎn)生的干擾因素；另一方面，前期研究均采用的動物實驗，本研究應(yīng)用人體PMN進行進一步研究。丙泊酚抗炎的最重要環(huán)節(jié)是減少炎性細(xì)胞因子的釋放，因此檢測PMN培養(yǎng)液中炎性細(xì)胞因子的濃度，可以反映抗炎效果。TNF-α、IL-8是最常見的炎性細(xì)胞因子，因此本研究選擇了對培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8濃度進行了檢測。結(jié)果顯示，LPS組比對照組上清液中TNF-α、IL-8均增加了2.5倍以上，而加入丙泊酚的P1、P2、P3組TNF-α、IL-8均出現(xiàn)了顯著下降，且具有劑量依賴性。劑量達(dá)到8μg/mL時效果最好，但仍顯著高于對照組（P＜0.05），也提示丙泊酚可能并不能完全抑制LPS引起的PMN釋放炎性細(xì)胞因子的增加。有研究顯示，巨噬細(xì)胞丙泊酚抗炎的重要靶細(xì)胞[2]。

NK-κB作用廣泛，參與炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄只是其作用之一[4]。NK-κB由p65/p50二聚體組成，正常狀態(tài)下和其抑制蛋白共同存在于胞質(zhì)內(nèi)。在機體受到特定刺激后，p65蛋白和p50迅速解離，跨過細(xì)胞核膜進入核內(nèi)，進而啟動下游炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，釋放炎性細(xì)胞因子。因此p65蛋白進入核內(nèi)是炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，檢測核內(nèi)p65的含量可以代表NK-κB激活水平。結(jié)果顯示，LPS組核內(nèi)p65顯著增加，加入不同濃度的丙泊酚組p65含量均出現(xiàn)了不同濃度的下降。這也與筆者對細(xì)胞因子濃度的檢測結(jié)果相一致。提示丙泊酚是通過抑制p65的激活減輕了炎性細(xì)胞因子的釋放。過量炎性細(xì)胞因子釋放是急性肺損傷（ALI）發(fā)病的重要機制，因此丙泊酚可以減少炎性細(xì)胞因子釋放，減輕ALI，這也在本課題前期動物實驗中得到證實[1]。

綜上所述，本實驗條件下證實，丙泊酚可以通過抑制p65蛋白的激活降低LPS激活人體PMN后釋放炎性細(xì)胞因子濃度。丙泊酚的這種抑制作用具有劑量依賴性。

[1]李莎，張焰，彭生.異丙酚對內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠中性粒細(xì)胞NF-κB 活化的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2010，30（7）：862-864.

[2]Hsing CH，Lin MC，Choi PC，et al.（2011）Anesthetic Propofol Reduces Endotoxic Inflammation by Inhibiting Reactive Oxygen Species-regulated Akt/IKKβ/NF-κB Signaling[J].PLoSONE，6（3）：17598.

[3]李莎，張焰，彭生.異丙酚對急性肺損傷大鼠肺組織凋亡及NF-κB p65 的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（5）：494-497.

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[5]Adrie C，Pinsky MR.The inflammatory balance in human sepsis[J].Intensive Care Medicine，2000，26（4）：364-375.