CydDC蛋白的表達及對谷胱甘肽運輸的影響

全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

CydDC蛋白的表達及對谷胱甘肽運輸的影響

全聰 張靜 吳輝 李志敏 葉勤

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

在重組大腸桿菌中共表達了谷胱甘肽運輸蛋白CydDC與雙功能合成酶GshF，通過增強對谷胱甘肽的運輸作用，提高谷胱甘肽產量。實驗結果表明，目的蛋白CydDC及GshF均成功表達；重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）總谷胱甘肽產量為0.22 mmol/L，胞外谷胱甘肽含量顯著增加，達到81.9%，分別是對照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）的1.11倍和1.29倍。

谷胱甘肽；運輸蛋白；共表達；重組大腸桿菌

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是胞內含量最豐富的硫醇類化合物，普遍存在于哺乳動物、植物、酵母及原核生物中，是由L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）、甘氨酸（Gly）組成的三肽［1］。GSH的生物學意義主要歸功于其半胱氨酸殘基上的巰基，因而具有獨特的氧化還原能力和親和屬性［2］。生物體蛋白質及DNA的合成以及細胞周期調控均離不開GSH的參與。同時，GSH還與細胞耐熱性、外分泌、生長維持、調節氧化還原平衡、解毒及半胱氨酸的儲存和運輸有關［3-6］。這種三肽還能調節基因表達、細胞凋亡、信號轉導及內外源分子的膜運輸，對維持胞內穩態具有重要作用［7］。

GSH已經廣泛應用于制藥、食品及化妝品行業，市場上對GSH的需求與日俱增。微生物發酵法生產GSH因其低成本、小污染、高密度、條件溫和等特點而備受青睞，但胞內高濃度的GSH積累造成的對關鍵合成酶的競爭抑制以及胞內毒性是GSH高產及產業化的兩大瓶頸［8，9］。雙功能酶基因gshF的發現解決了產物的抑制問題，GshF同時具有谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）及谷胱甘肽合成酶（GS）活性，對GSH不敏感，在生產上具有極大潛力，在生產宿主中過表達gshF后，GSH的生產得到促進，且檢測不到發酵中間物γ-谷氨酰半胱氨酸的存在［10］。當GSH合成酶的活力問題得到解決，高濃度GSH的胞內毒性問題就顯得非常突出。

利用微生物發酵法生產時，GSH的合成主要發生在胞內，而GSH在胞內主要以還原型多肽形式存在，產物積累過多會擾亂氧化還原平衡，對菌體生長及代謝帶來嚴重影響，引起代謝控制阻遏產物積累，甚至導致細胞自溶［8］。因此將GSH由胞內轉運到胞外不僅是降低其胞內積累的有效手段，而且也是提高產量的重要方法之一。同時，在GSH的下游提取過程中，因其為胞內產物，要獲得純品就需先將其從細胞中提取出來，主要采用提取工藝中破碎法，但因釋放出GSH時會附帶出雜質成分如蛋白質、核酸、氨基酸等細胞組分以及細胞碎片，使得分離過程耗時耗力、成本增加，如果GSH被細胞主動轉運到胞外，能節省不必要的工序、簡化工藝［11］。此外，GSH在胞內的平衡濃度及其生理功能也與其運輸有關［12］，因此對GSH運輸蛋白的研究至關重要。

關于原核生物的GSH運輸蛋白，國外研究多有報道。Pittman等［13］確定了原核生物第一個GSH運輸系統即CydDC復合物，該復合物為膜運輸蛋白，運輸過程需要ATP參與。CydDC作為大腸桿菌異質二 聚 體ABC（ATP-binding cassette-type transporter）型運輸系統，最初發現于E. coli細胞色素bd型末端氧化酶的裝配過程中；1993年發現其為ABC運輸蛋白［14］；2002年，證明cysteine經CydDC進入翻轉膜泡，最后被運出細胞質達到壁膜間隙［15］；2005年證明該運輸蛋白能運輸GSH到周質中。CydDC對還原型GSH有高親和力，但對氧化型及GSH結合物親和力低，故運輸GSH而不運輸GSSG。專利中也實現了CydDC的表達［16］。

為降低胞內產物積累、減少生產阻遏及胞內毒性進而提高產量，本文重點研究目的蛋白CydDC的表達對產GSH重組大腸桿菌胞外GSH濃度的影響，以期促進GSH的生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 本研究所使用的菌株及質粒如表1所示。

表 1 菌株及質粒

1.1.2 試劑及培養基

1.1.2.1 試劑 GSH標準品購自Sigma公司；氯霉素、氨芐青霉素購自上海捷倍思基因技術有限公司；質粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR MasterMix、Hind III、PrimeSTAR HS（Premix）購自天根生化科技有限公司。

1.1.2.2 培養基 Luria-Bertani液體培養基：Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃滅菌20 min。Luria-Bertani固體培養基：上述液體培養基中加入1.6 g/L瓊脂粉，121℃滅菌20 min。搖瓶培養基：含5 g/L glucose的50 mL Luria-Bertani液體培養基，葡萄糖與Luria-Bertani分開滅菌，葡萄糖115℃滅菌20 min。培養基中添加合適的抗生素：氯霉素34 mg/L，氨芐青霉素50 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 重組質粒構建 重組質粒pBAD33-cydDC構建過程，如圖1，根據載體pBAD33設計引物，使PCR擴增出的目的片段cydDC兩端帶有載體的同源臂，cydDC上游引物序列含20 bp載體同源臂，序列為：5'-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGGAGGACAGCTATGAATAAATCTCGTCAAAA-3'（下劃線部分為Hind III酶切位點，斜體部分為核糖體結合位點）；下游引物序列包含載體酶切位點Hind III右側20 bp同源臂，序列為：5'-CCGCCAAAACAGCCAAGCTT TTACAAACCCTGCTTGAACT-3'。PCR獲得目的片段后，利用ClonEXpressTMII試劑盒將cydDC片段與經Hind III酶切后線性化的質粒pBAD33進行同源重組，37℃反應30 min進行連接，再將連接后得到的重組質粒轉化MG1655感受態細胞，經氯霉素篩選出抗性重組菌。取質粒pBAD33多克隆位點兩側各20 bp序列作為驗證引物，其中上游引物序列為：5'-GCTCTTCTCGCTAACCAAAC-3'，下游引物序列為：5'-GTTCACCGACAAACAACAGAT-3'，對重組菌進行PCR驗證，并且抽提質粒送上海生工進行測序驗證。

1.2.1.2 含雙質粒的重組菌構建 利用氯化鈣轉化法將重組質粒pTrc99a-as轉入大腸桿菌MG1655（pBAD33-cydDC），過夜培養，經含有氨芐青霉素及氯霉素的平板篩選，挑取單菌落，保種并進行PCR驗證，待PCR驗證后進行蛋白電泳。

1.2.1.3 培養 重組菌于裝有3 mL Luria-Bertani液體培養基試管中復蘇，放于37℃、220 r/min搖床培養9 h，轉接搖瓶培養基，菌濃OD600=0.5時加入0.5 mmol/L IPTG及50 mmol/L阿拉伯糖誘導，并按時取樣，時間點為2.5、5和8.5 h，檢測發酵液及上清液中GSH的產量并計算其胞外含量。

圖1 質粒pBAD33-cydDC構建圖

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體密度測定 菌體培養過程中，用可見光分光光度計在600 nm檢測菌液的吸光值。

1.2.2.2 GSH的測定 樣品經三氯乙酸TCA處理20 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液稀釋10倍后經0.22 μm膜過濾處理方可進樣。液相條件：C18柱（4.6×150 mmol/L），流動相A為含0.01 mol/L庚烷磺酸鈉和0.05 mol/L磷酸二氫鉀的溶液（磷酸調pH3.0），流動相B為甲醇；液相檢測時流動相為95%的A和5%的B的混合液，流速1.0 mL/min，紫外檢測器波長為210 nm，柱溫30℃。

1.2.2.3 電泳分析 核酸電泳緩沖液及蛋白電泳緩沖液、染色、脫色液的配制參見《分子克隆》。

2 結果

2.1 重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）的構建

根據圖1構建的重組質粒pBAD33-cydDC的PCR驗證結果，見圖2。以空質粒pBAD33為模板，驗證引物進行PCR擴增，只能得到長度不足100 bp的產物，而以重組質粒為模板時，PCR產物長度為3 500 bp，測序結果正確，表明重組質粒構建成功并順利獲得重組菌MG1655（pBAD33-cydDC）。

圖2 重組質粒pBAD33-cydDC的PCR驗證

2.2 重組蛋白CydDC的表達

重組菌株MG1655（pBAD33-cydDC）經阿拉伯糖誘導后，進行SDS-PAGE電泳，電泳結果如圖3所示。文獻報道中的CydDC兩亞基理論大小為61、59 kD［4］，圖中實驗組可見兩條清晰區帶，與對照組相比，蛋白條帶亮度增加，且大小與理論值相吻合，表明目的蛋白成功表達。

圖3 重組菌cydDC基因的表達

2.3 重組菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）的蛋白表達

含雙質粒的重組菌經IPTG和阿拉伯糖誘導后，進行SDS-PAGE電泳。結果（圖4）顯示，與對照組相比，實驗組有3條清晰區帶，分別位于85、61和59 kD處，與理論位置相符，目的蛋白GshF及CydDC均表達成功。

圖4 重組菌目的基因的表達

2.4 谷胱甘肽的合成和運輸

分別對MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）和MG-1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）進行培養，并檢測培養細胞的谷胱甘肽合成。結果（圖5）顯示，誘導后，隨著培養時間延長，GSH產量逐漸增加，5 h達到最高，8.5 h因產物降解及氧化，產物積累有所降低。運輸蛋白CydDC的過表達促進了產物谷胱甘肽的生產，5 h時重組菌MG1655（pTrc99a-as/ pBAD33-cydDC）的GSH產量是MG1655（pTrc99aas/pBAD33）的1.11倍。

胞外GSH含量對比結果（圖6）顯示，搖瓶培養時，對照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）胞外GSH含量達63.4%；過表達cydDC基因能促進GSH的胞外運輸，MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）胞外GSH占總GSH的81.9%，是對照的1.29倍。

3 討論

底物的有效輸出一直是高密度發酵法生產GSH所需解決的重要問題之一，國內外就如何提高胞外GSH含量做了許多研究。李華鐘等［17］構建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重組大腸肝菌，在發酵過程中對菌體進行通透性處理使得產物GSH分泌到細胞外，產量得到提高，但處理過程使用到甲苯等有毒的有機溶劑，不利于工業化。Perrone等［18］構建一株重組酵母菌，過表達gshⅠ和gshⅡ，并失活hac1及hgt1等相關基因，使酵母菌發酵過程中GSH分泌到胞外，但專利報道總GSH產量僅為0.06 mmol/L，胞外為0.03 mmol/L。Nie等［19］在利用產阮假絲酵母高密度發酵生產的基礎上，考察了低pH脅迫對GSH合成的影響，結果表明，在發酵24 h后將pH由5.5降至1.2并維持6 h，細胞內的GSH幾乎全部釋放到胞外，GSH終產量是未處理前的1.25倍。

圖5 GSH生產對比

圖6 發酵樣品上清液中GSH含量對比

無論是添加表面活性劑對發酵菌體進行通透性處理，還是改變發酵條件進行脅迫，對GSH的分泌都起到一定作用，但同時也增加了發酵過程的操作難度及下游分離操作的難度，可見對菌體本身改造的重要性。

除了原核生物的GSH運輸蛋白，真核生物的運輸系統國外也有報道。Ballatori等［20］闡述了還原性谷胱甘肽的運輸機制，介紹了膜蛋白家族MRP/CFTR/ABCC和OATP/SLC21A在谷胱甘肽運輸中的作用。Kaluzna等［21］研究了大腸桿菌中谷胱甘肽S結合體的運輸，證明了其與真核細胞運輸的過程一致。Bourbouloux等［22］闡明了酵母高親密性谷胱甘肽輸入蛋白Hgt1p（OPT系統成員），該系統與其他酵母和一些植物中運輸GSH的系統相似，但與大腸桿菌及大多高等真核生物中的不同。許善峰［23］專利中報道了一株重組畢赤酵母，能分泌生產GSH，其特征在于過表達基因MRP2突變體，并失活胞外向胞內運輸谷胱甘肽的基因Hgt1，產物的運輸得到明顯改善，GSH產量也得到顯著提高。CydDC作為原核生物的膜結合型運輸蛋白，目前尚無在大腸桿菌中過表達以改善GSH運輸的報道。本研究實現了GSH運輸蛋白的表達，驗證了其運輸作用，對今后進一步提高GSH發酵生產具有重要意義。

4 結論

本研究在大腸桿菌中過表達ABC型蛋白CydDC，并驗證了其對谷胱甘肽的運輸作用。過表達cydDC基因的重組菌，谷胱甘肽產量得到提高，達到0.22 mmol/L，且胞外GSH含量明顯增加，達到81.9%，分別是對照的1.11倍和1.29倍。

［1］Anderson ME. Glutathione：an overview of biosynthesis and modulation［J］. Chemico-Biological Interactions, 1998, 111-112：1-14.

［2］Penninckx MJ. A short review on the role of glutathione in the response of yeasts to nutritional, environmental, and oxidative stresses［J］. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26（9-10）：737-742.

［3］DeLeve LD, Kaplowitz N. Importance and regulation of hepatic glutathione［J］. Seminnars in Liver Disease, 1990, 10（4）：251-266.

［4］Meister A. New developments in glutathione metabolism and their potential application in therapy［J］. Hepatology, 1984, 4（4）：739-742 .

［5］Meister A, Anderson ME. Glutathione［J］. Annual Review of Biochemistry, 1983, 52：711-760.

［6］Wang W, Ballatori N. Endogenous glutathione conjugates：occurrence and biological functions［J］. Pharmacological Reviews, 1998, 50（3）：335-356.

［7］Hammond CL, Lee TK, Ballatori N. Novel roles for glutathione in gene expression, cell death, andmembrane transport of organic solutes［J］. Journal of Hepatology, 2001, 34（6）：946-954.

［8］Paul GR, Alton M. Regulation of γ-glutamyl-cysteine synthetase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione［J］. The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（4）：1422-1426.

［9］Srikanth CV, Bachhawat AK, Bourbouloux A. Multiple cis-regulatory elements and the yeast sulphur regulatory network are required for the regulation of the yeast glutathione transporter, Hgt1p［J］. Current Genetics, 2005, 47（6）：345-358.

［10］Ge S, Zhu T, Li Y. Expression of bacterial GshF in Pichia pastoris for glutathione production［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78（15）：5435-5439.

［11］野口真夫. 谷胱甘肽精制法：日本, 52100421［P］. 1997.

［12］Ballatori N, Krance SM. Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology［J］. Mol Aspects Med, 2009, 30（1-2）：13-28.

［13］ Pittman MS, Robinson HC, Poole RK. A Bacterial glutathione transporter（Escherichia coli CydDC）exports reductant to the periplasm［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（37）：32254-32261.

［14］RK Poole. Cytochrome bd biosynthesis in Escherichia coli：the sequences of the cydC and cydD genes suggest that they encode the components of an ABC membrane transporter［J］. Molecular Microbiology, 1993, 10（2）：421-430.

［15］Pittman MS, Corker H. Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly［J］. J Biol Chem, 2002, 277（51）：49841-49849.

［16］Poole R. Overexpression of the cyddc transporter. WO 2004/113373 A1［P］. 2004.

［17］李華鐘, 李寅, 林金萍, 等. 具有高谷胱甘肽合成活性重組大腸桿菌的構建及合成反應過程［J］. 微生物學報, 2001, 41（1）：16-23.

［18］Perrone GG, Dawes IW, Grant CM. Glutathione production. WO 2004/003217 A1［P］. 2004.

［19］Nie W, Wei G, Du G, et al. Enhanced intracellular glutathione synthesis and excretion capability of Candida utilis by using a low pH-stress strategy［J］. Lett Appl Microbiol, 2005, 40（5）：378-384.

［20］Ballatori N, Hammond CL, Cunningham JB, et al. Molecular mechanisms of reduced glutathione transport：role of MRP/CFTR/ ABCC and OATP/SLC21A families of membrane proteins［J］. Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, 204（3）：238-255.

［21］Kaluzna A, Bartosz G. Transport of glutathione s-conjugates in Escherichia coli［J］. Biochemistry and Molecular Biology for Life Scientists, 1997, 43（1）：161-171.

［22］Bourbouloux A, Shahi P, Chakladar A, et al. Hgt1p, a high affinity glutathione transporter from the yeast Sacchraomyces cerevisiae［J］. J Biol Chem, 2000, 275（18）：13259-13265.

［23］許善峰. 分泌生產谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法：中國, 103087932A［P］. 2013-05-08.

（責任編輯 狄艷紅）

Expression of CydDC in Escherichia coli and the Effect of It on Glutathione Transportation

QUAN Cong ZHANG Jing WU Hui LI Zhi-min YE Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

This study is to co-express the CydDC and GshF in the recombinant Escherichia coli，and to increases the glutathione production by enhancing glutathione transportation. As the results from the experiments，the target protein CydDC and GshF were successfully expressed，the glutathione production of MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）reached 0.22 mmol/L，and the content of glutathione in supernatant significantly increased and reached 81.9%，which was 1.11-fold and 1.29-fold of control strain MG1655（pTrc99a-as/pBAD33），respectively.

glutathione；transporter；co-expression；recombinant Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.033

2016-03-23

上海市產學研醫合作項目

全聰，男，碩士，研究方向：發酵工程；E-mail：masterjackiequan@163.com

李志敏，女，博士，教授，研究方向：生物化工、發酵工程、代謝工程及微生物生理和代謝調控；E-mail：lizm@ecust.edu.cn