鉤藤提取物對MPTP誘導帕金森病模型小鼠神經元的影響

盧芳，井月娥，任燕冬，張淑香，劉樹民

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯醫學院，黑龍江 佳木斯 154000

鉤藤提取物對MPTP誘導帕金森病模型小鼠神經元的影響

盧芳1，井月娥1，任燕冬2，張淑香1，劉樹民1

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯醫學院，黑龍江 佳木斯 154000

目的 探討鉤藤提取物對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）誘導帕金森病（PD）模型小鼠神經元保護的作用機制。方法 將C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、鉤藤組及美多芭組，腹腔注射MPTP法制備PD小鼠模型。行為學測試小鼠抓握和肢體運動協調能力；生化法測定小鼠中腦黑質超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）水平，酶聯免疫法測定白細胞介素（IL）-1β、IL-6的活性。結果 與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數減少、爬桿時間延長（P＜0.05），腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠自主活動次數增多、爬桿時間縮短（P＜0.05），腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯上升，MDA、IL-1β及IL-6含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結論 鉤藤提取物對PD模型小鼠的治療作用可能是通過清除氧自由基、提高機體抗氧化能力和抑制炎癥反應，從而減少神經元的凋亡實現的。

帕金森病；鉤藤提取物；神經保護；小鼠

帕金森病（Parkinson disease，PD），亦名震顫性麻痹，是一種常見的慢性神經系統退行性疾病，以靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩和姿勢反射性受阻為典型臨床特征，并通常伴有精神障礙、認知障礙或睡眠障礙，導致患者失去生活能力。目前對于PD的發病機制并未明確的界定，多巴胺/乙酰膽堿等神經遞質失調、氧化應激、免疫炎性機制等因素被認為參與了中腦黑質部位神經元的病變。對于PD的臨床治療，全球范圍內普遍以西藥治療為主，而“金藥物”美多芭也僅能改善患者的癥狀，無法阻止疾病的發展進程[1]，且服用西藥通常會出現一系列的不良反應，所以，尋求一種中藥保護制劑迫在眉睫。鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝。已有研究顯示鉤藤對于PD患者癥狀具有改善作用[2]。本研究從鉤藤提取物入手，檢測在氧化應激反應中起重要作用的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）3項指標，以及神經炎癥過程中2種重要的細胞因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6來探討鉤藤提取物對神經元保護的作用機制，為開發預防或治療PD的新藥提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

健康C57BL/6雄性小鼠32只，2月齡，體質量（20±2）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心動物實驗室，飼養溫度（22±1）℃、濕度（60±5）%，自由飲食、飲水。

1.2 藥物

鉤藤藥材購于黑龍江省藥材公司，經黑龍江中醫藥大學劉樹民教授檢驗符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準。水浴溫度80 ℃，70%乙醇提取2次，加醇量分別為10、8倍，提取時間分別為2、1.5 h。合并濾液，60 ℃真空旋至浸膏，最后冷凍干燥得鉤藤提取物。多巴絲肼片，上海羅氏制藥有限公司，批號SH1778。

1.3 主要試劑與儀器

鉤藤堿（成都普菲德生物技術有限公司，批號150515）、異鉤藤堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111927-201403），羧甲基纖維素鈉（天津市凱通化學試劑有限公司），1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP，美國Sigma公司），SOD、MDA、GSH-Px測試盒和IL-1β、IL-6酶聯免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所。Waters2695高效液相色譜儀（日本島津），ZZ-6小鼠自主活動測試儀（成都泰盟），KDC-160HR高速冷凍離心機（科大創新），UV-2450可見分光光度計（日本島津）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-水（60∶40）含10 mmol/L三乙胺，乙酸調pH值7.5；流速：1 mL/min；測定波長：254 nm；在所擬色譜條件下，鉤藤堿的理論塔板數不低于1500。精密稱取鉤藤堿或異鉤藤堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg溶液，即得對照品溶液。取鉤藤總堿20 mg，用甲醇溶解后濾過，25 mL定容，即得供試品溶液，進樣量20 μL，測定鉤藤總堿中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。經HPLC檢測，自提的鉤藤提取物中鉤藤堿含量為0.13%、異鉤藤堿含量為0.18%，色譜圖見圖1。

圖1 異鉤藤堿、鉤藤堿HPLC圖

2.2 分組、造模及給藥

參照文獻[3]腹腔注射MPTP法制備C57BL/6小鼠PD模型。將小鼠隨機分為對照組、模型組、鉤藤組及美多芭組，每組8只。適應性喂養1周后，造模組予MPTP腹腔注射30 mg/（g?d），連續5 d，制備PD小鼠模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。造模結束后，鉤藤組予鉤藤提取物混懸液灌胃，根據前期藥效學實驗選擇最佳劑量818 mg原藥材/（kg?d）；美多芭組予多巴絲肼片懸濁液0.12 mg/g灌胃；模型組和對照組予等量羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃。給藥體積0.1 mL/10 g體質量，1次/d，連續20 d。

2.3 行為學測試方法

各組小鼠于實驗前1周每日進行1次爬桿、自主活動行為訓練，于取材前進行爬桿和自主活動實驗檢測其抓握能力和肢體運動協調能力。爬桿實驗：將一直徑為2.5 cm泡沫塑料小球固定于一根60 cm長1 cm粗鐵桿頂端，桿上纏繞醫用膠帶以防打滑。將小鼠放至球頂，松手的同時開始計時，記錄小鼠落到地面的時間。自主活動實驗：將小鼠放到自主活動儀內，適應黑暗環境3 min，然后開始計時5 min，記錄小鼠規定時間內的活動次數。

2.4 腦組織勻漿液制備

行為學測試后，將各組實驗小鼠于冰上斷頭取腦，將黑質部位置于凍存管中，液氮速凍并于-80 ℃冰箱保存。MDA、SOD樣品制備：準確稱取小鼠腦組織質量，按質量（g）∶體積（mL）＝1∶9比例加9倍生理鹽水，冰水浴條件下，機械勻漿，制備成濃度為10%勻漿液，3000 r/min離心10 min，取上清液分裝待測。GSH-Px樣品制備：取上述10%樣品勻漿液，用生理鹽水稀釋成1%樣品待測。IL-1β、IL-6樣品制備：準確稱取小鼠腦組織質量，按質量（g）∶體積（mL）＝1∶9比例加9倍體積PBS（pH 7.4），冰水浴條件下，機械勻漿，制備成濃度為10%勻漿液，3000 r/min離心20 min，收集上清液，分裝待測。

2.5 指標檢測

取已制備好的相應濃度樣品，實驗按照各試劑盒說明書進行操作。SOD、MDA、GSH-Px樣品采用生化法測定，分別以分光光度計于550、532、412 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調零，比色。IL-1β、IL-6樣品采用酶聯免疫法測定，于酶標儀波長450 nm處測定光密度（OD）值。

3 統計學方法

4 結果

4.1 一般狀況

實驗開始2 d后，造模小鼠逐漸開始出現頭部和前肢不自主抖動、頸部和背部體毛戰栗、活動減少現象，提示PD小鼠模型成功。小鼠在連續腹腔注射MPTP 5 d內體質量呈下降趨勢。

4.2 行為學測定結果

與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數減少、爬桿時間延長（P＜0.05）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠自主活動次數增多、爬桿時間縮短（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠自主活動次數和爬桿時間比較（±s）

表1 各組小鼠自主活動次數和爬桿時間比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數 自主活動/（次/5 min） 爬桿時間/s對照組 8 72.14±13.88 6.5±1.38模型組 8 60.57± 8.40 9.0±1.79*鉤藤組 8 74.57± 9.41#6.4±0.55#美多芭組 8 70.00±14.50 5.8±1.61##

4.3 鉤藤提取物對模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽-過氧化物酶、白細胞介素-1β和白細胞介素-6水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯升高，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px、IL-1β及IL-6水平比較（±s）

表2 各組小鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px、IL-1β及IL-6水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數 SOD/（U/mg） MDA/（nmol/mg） GSH-Px/（U/mg） IL-1β/（ng/g） IL-6/（pg/g）對照組 8 115.13±10.58 0.87±0.16 13.49±1.35 20.49±3.79 11.69±3.39模型組 8 80.29± 8.18**1.47±0.16**11.24±1.25*29.49±4.63*15.52±0.92*鉤藤組 8 113.61±12.12##1.20±0.13#14.14±2.44#22.01±3.26##12.28±1.84##美多芭組 8 115.00±10.93##1.13±0.02#13.26±1.58#17.91±6.38#11.49±0.99##

5 討論

氧化應激學說認為，多巴胺氧化代謝產物造成細胞內氧化壓力過盛和細胞抗氧化能力不足是PD黑質多巴胺能神經元自發退變的主要原因。GSH-Px、SOD均是體內重要的自由基清除劑，可有效清除H2O2及O2–等自由基。MDA含量也可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映細胞損傷的程度。本實驗結果顯示，模型組小鼠腦組織GSH-Px酶活性明顯低于對照組（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.01），而清除O2–的抗氧化酶SOD酶活性顯著降低（P＜0.01），經給予鉤藤提取物和美多芭治療后，MDA含量有所下降（P＜0.05）、SOD酶活性增強（P＜0.01），均向對照組水平靠近，GSH-Px酶活性升高（P＜0.05）。本實驗結果表明，PD模型小鼠黑質內GSH-Px含量下降及抗氧化自由基酶類活性的改變都體現了經MPTP誘導后，小鼠腦組織清除自由基的功能明顯不足，而給予藥物治療后，各項指標均被改善，提示鉤藤提取物可通過清除氧自由基、增強機體抗氧化能力及減少細胞凋亡的途徑保護神經元。

氧化應激除發生在神經元，也發生在神經膠質細胞。膠質細胞的激活，尤其是小膠質細胞的激活，是PD病理的重要組分[4]。小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞，當受到外界刺激時會被激活而分泌一系列的細胞因子，其中IL-1β是炎癥反應過程中最早被動員的細胞因子，它還可以激活巨噬細胞等分泌IL-6。在PD患者尸檢中，黑質紋狀體系統內明顯可見主要分布在激活的小膠質細胞上的IL-1β等炎癥因子，且炎癥因子的表達與多巴胺神經元的丟失呈正相關[5]。IL-1β、IL-6均是炎癥反應的中心環節，且同時具有免疫調節、抗炎、保護神經元、促進神經元修復等作用[6]。本實驗結果顯示，造模后模型小鼠黑質內IL-1β、IL-6的含量明顯升高（P＜0.05），經鉤藤提取物治療后，二者含量顯著下降（P＜0.01）。鉤藤提取物能夠通過抑制MPTP誘導的PD模型小鼠IL-1β、IL-6的表達，提示其可能通過阻斷或減弱PD黑質神經膠質細胞的炎癥反應來減少神經元的變性。

綜上所述，鉤藤提取物對MPTP誘導PD模型小鼠的神經保護作用是通過清除氧自由基、提高機體抗氧化能力及抑制神經炎癥反應而實現的。

[1] HATTINGEN E, MAGERKURTH J, PILATUS U, et al. Phosphorus and proton magnetic resonance spectroscopy demonstrates mitochondrial dysfunction in early and advanced Parkinson's disease[J]. Brain,2009,132(12)：3285-3297.

[2] SHIM J S, KIM H G, JU M S, et al. Effects of the hook of Uncaria rhynchophylla on neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease[J]. J Ethnopharmacol,2009,126(2)：361-365.

[3] LIU SH M, LI X ZH, HUO Y, et al. Protective effect of the effective parts of acanthopanax senticosus Harms on dopaminergic neurons in Parkinson's disease mice[J]. Phytomedicine,2012,19(7)：631-638.

[4] QIAN L, FLOOD P M, HONG J S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and prime target for therapy[J]. J Neural Transm,2010,117(8)：971.

[5] MIKLOSSY J, DOUDET D D, SCHWAB C, et al. Role of ICAM-1 in persisting inflammation in Parkinson's disease and MPTP monkeys[J]. Exp Neurol,2006,197(2)：275.

[6] 王玖飛,王坤.炎性細胞因子在大鼠缺氧缺血性腦損傷中含量變化及其意義[J].黑龍江醫藥科學,2008,31(3)：8-9.

Effects of Uncariae Ramulus Cum Uncis Extract on Neurons of MPTP-induced PD Model

Mice

LU Fang1, JING Yue-e1, REN Yan-dong2, ZHANG Shu-xiang1, LIU Shu-min1(1. Heilongjiang University of

Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. Jiamusi Medical College, Jiamusi 154000, China)

Objective To study the neuron protection mechanism of Uncariae Ramulus Cum Uncis extract for the MPTP-induced PD mice. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group, and injected with MPTP in abdominal cavity. Behavior test was used to detect grabbing capacity and body movement coordination capacity: three biochemical indexes (SOD, MDA, GSH-Px) were detected by biochemical process and the activity of two immune enzyme-linked indexes (IL-1β, IL-6) were detected by enzymelinked immunosorbent assay. Results Compared with the control group, the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the model group (P<0.05), enzymatic activity of SOD and GSH-Px decreased significantly and the contents of MDA, IL-1β and IL-6 increased obviously (P<0.01). Compared with model group, the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group (P<0.05). Enzymatic activity of SOD and GSH-Px increased and the contents of MDA and IL-1β and IL-6 decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Uncariae Ramulus Cum Uncis extract can reduce neuronic apoptosis PD mice, whose therapeutic action may be realized through eliminating oxygen free radicals, improving oxidation resistance and reducing inflammatory reactions.

Parkinson’s disease; Uncariae Ramulus Cum Uncis; neuroprotection; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.015

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0057-04

2015-06-03）

（

2015-07-15；編輯：華強）

國家自然科學基金青年基金（81303249）；中國博士后科學基金（2013T60398）；博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動資助基金（LBH-Q13160）；黑龍江中醫藥大學科研基金（2013jc01）

劉樹民，E-mail：keji-liu@163.com