Nd: YAG激光對(duì)牙根面結(jié)構(gòu)及變異鏈球菌黏附的影響

李圓紅 李忠成 羅夢(mèng)奇 申道南 張舒 孟姝

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

Nd: YAG激光對(duì)牙根面結(jié)構(gòu)及變異鏈球菌黏附的影響

李圓紅 李忠成 羅夢(mèng)奇 申道南 張舒 孟姝

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

目的 研究不同功率的水冷Nd: YAG激光照射治療對(duì)牙根面結(jié)構(gòu)及變異鏈球菌黏附的影響。方法 將因重度慢性牙周炎拔除的離體牙分為4組，均進(jìn)行手工刮治和根面平整，制備牙根片，激光1、2、3組分別用功率為4、6、8 W的水冷Nd: YAG激光照射處理60 s，對(duì)照組不作處理。用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察各組根片的表面結(jié)構(gòu)。將變異鏈球菌接種于各組牙根片表面并進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)各組根片表面細(xì)菌的黏附量（CFU·mL-1）；同時(shí)用SEM觀察對(duì)照組及激光2組根面的細(xì)菌黏附情況。結(jié)果 SEM觀察根片表面結(jié)構(gòu)，激光組較對(duì)照組牙根表面的玷污層、碎屑及菌斑樣物質(zhì)附著減少，但裂隙增多。3個(gè)激光組牙根表面的細(xì)菌黏附量均少于對(duì)照組（P＜0.05），而不同功率的激光組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SEM觀察細(xì)菌黏附情況，激光2組表面的細(xì)菌黏附量明顯少于對(duì)照組。結(jié)論 與單純刮治相比，刮治后進(jìn)行水冷Nd: YAG激光治療能清除牙根表面的玷污層、碎屑及菌斑樣物質(zhì)，并能減少變異鏈球菌的黏附，但激光會(huì)導(dǎo)致牙根表面出現(xiàn)裂隙。本實(shí)驗(yàn)中，6 W為激光最佳功率，既能較好地去除牙根表面的玷污層和碎屑等，又能較好地控制激光對(duì)根面的熱損害程度。

Nd: YAG激光； 變異鏈球菌； 根面

牙周炎和齲病是人口腔內(nèi)常見(jiàn)的慢性感染性疾病，慢性牙周炎由于牙槽骨吸收、牙周袋形成、牙齦萎縮常導(dǎo)致牙根表面暴露。研究[1]發(fā)現(xiàn)，不同口腔環(huán)境中牙周致病菌與變異鏈球菌在數(shù)量上通常呈負(fù)相關(guān)。牙周基礎(chǔ)治療后，牙周生態(tài)環(huán)境改變，變異鏈球菌等致齲菌數(shù)量增加，根面齲的易患性增加，牙根面細(xì)菌由牙周致病菌轉(zhuǎn)變?yōu)橐宰儺愭溓蚓鸀榇淼闹慢x菌。致齲菌發(fā)揮致病作用主要是以牙菌斑生物膜的形式，而變異鏈球菌作為公認(rèn)的主要致齲菌之一，其對(duì)牙面的黏附是口腔菌斑成熟與向致齲性菌斑轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，是牙菌斑形成的前提，也是其致齲的重要基礎(chǔ)。口腔內(nèi)菌斑形成的首要階段是獲得性膜形成和細(xì)菌的初期聚集，變異鏈球菌在牙面的初始黏附實(shí)際上是細(xì)菌在唾液獲得性膜上的黏附，變異鏈球菌的初始黏附對(duì)之后菌斑內(nèi)細(xì)菌的迅速生長(zhǎng)增殖聚集起著重要作用[2]。Nd: YAG激光作為一種非手術(shù)治療手段，因其具有殺菌、緩解牙本質(zhì)敏感等作用[3-4]，目前正廣泛應(yīng)用于口腔疾病的輔助治療當(dāng)中。目前關(guān)于激光作為輔助治療手段與單獨(dú)刮治治療牙周病相比，細(xì)菌對(duì)牙面黏附的差異以及激光治療時(shí)參數(shù)的選擇等還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同功率的激光照射組與單純刮治組進(jìn)行比較，探討激光對(duì)牙根面結(jié)構(gòu)及變異鏈球菌黏附的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本制備

1.1.1 樣本選擇 收集因重度牙周炎拔除的磨牙和前磨牙，用生理鹽水沖洗后備用。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）Ⅲ度松動(dòng)的嚴(yán)重患牙，鄰面牙周袋及附著喪失大于5 mm，無(wú)保留價(jià)值，存在齦下牙石；2）近半年內(nèi)未進(jìn)行過(guò)牙周治療，未服用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）患牙根面有齲壞或缺損；2）患有全身系統(tǒng)性疾病。

1.1.2 分組處理和牙根片制備 離體牙分別在牙根標(biāo)記處理范圍后，用刮治器對(duì)所有牙齒的根面進(jìn)行刮治處理，使根面無(wú)殘留軟組織及牙石附著，用尖銳探針探查及肉眼觀察根面平整光滑。在鄰面釉牙骨質(zhì)界下約1 mm處向根方做出3 mm×3 mm的標(biāo)記。

將處理后的患牙隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、激光1組、激光2組、激光3組。對(duì)照組不作其他處理，為單純刮治組；激光1、2、3組用波長(zhǎng)為1 064 nm，輸出功率分別為4 W（每次脈沖80 mJ）、6 W（每次脈沖120 mJ）、8 W（每次脈沖160 mJ）的水冷Nd：YAG激光（Genius公司，丹麥）連續(xù)照射60 s。照射時(shí)激光光纖與根面輕觸且成小于30°照射角度，在牙面冠根方上下快速掃描式移動(dòng)，覆蓋整個(gè)標(biāo)記區(qū)域。各組其他參數(shù)的設(shè)置均一致：水和氣均采取激光機(jī)的第“8”檔，頻率每秒50次，使用的光纖頭直徑為600 μm[5-10]。

取上述處理完成后的所有牙齒，分別在水冷卻下從鄰面釉牙骨質(zhì)界下約1 mm處向根方切取3 mm× 3 mm×l mm的根片，每張根片除牙根表面之外的其余各面均用細(xì)砂紙打磨光滑平整，分別從每組中選取較為平整的根片，其中對(duì)照組（單純刮治）14片，激光1組（4 W）12片，激光2組（6 W）14片，激光3組（8 W）12片，過(guò)氧化氫等離子滅菌后備用。

1.2 各組根片表面結(jié)構(gòu)觀察

從每組樣本中分別隨機(jī)抽取2張根片，生理鹽水沖洗干凈，干燥、噴金，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）下觀察根片的表面形態(tài)。

1.3 細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)

1.3.1 菌株、材料與儀器 變異鏈球菌參考株UA159（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；腦心浸液（brain-heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（Oxoid公司，英國(guó)），唾液，生理鹽水。0.22 μm孔徑濾器（Millipore公司，美國(guó)），細(xì)菌培養(yǎng)箱（義烏冷凍機(jī)總廠），分光光度計(jì)（Shimadzu公司，日本），漩渦振蕩器（IKA公司，德國(guó)）。

1.3.2 唾液與牙根片的準(zhǔn)備 選擇1名健康成人志愿者，進(jìn)食2 h后用清水漱口，不加任何刺激物收集唾液20 mL，置于離心管中，4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，以0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用[11]。將根片浸泡在唾液中24 h，形成人工獲得性膜，制成唾液包被牙根片。

1.3.3 細(xì)菌培養(yǎng)及菌液制備 將變異鏈球菌凍干菌株接種于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃、混合氣（體積分?jǐn)?shù)氮?dú)鉃?5%、氫氣為10%、二氧化碳為15%）條件下培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落接種于 BHI 液體培養(yǎng)基，繼續(xù)于上述條件下培養(yǎng)18 h，經(jīng)涂片檢查為純培養(yǎng)后采用分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)菌懸液的密度，用BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌懸液的密度，用菌落形成單位（colony forming unit，CFU）表示，調(diào)整至1×108CFU·mL-1，備用。

1.3.4 細(xì)菌接種于根片 將處理過(guò)的剩余根片表面朝上置于48孔板底部，將細(xì)菌接種于含根片的48孔板中，每孔100 μL，再加入BHI液體培養(yǎng)基900 μL，于37 ℃、混合氣條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)及SEM觀察。

1.3.5 細(xì)菌計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后，各組選取10個(gè)標(biāo)本，用滅菌生理鹽水清洗10次，去除表面沒(méi)有黏附的菌落，放入盛有5 mL滅菌生理鹽水的試管中備用。漩渦振蕩器上振蕩30 s。將標(biāo)本原液用10倍系列稀釋法稀釋，選擇稀釋倍數(shù)為10、100、1 000的菌液，分別取稀釋液0.1 mL接種于BHI固體培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，選擇菌落計(jì)數(shù)為20～200個(gè)之間的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后即得到黏附量，單位為CFU·mL-1。

1.3.6 SEM觀察細(xì)菌黏附情況 分別將對(duì)照組及激光2組（6 W）剩余的2張根片取出，用無(wú)菌生理鹽水將根片沖洗干凈，放入2.5%戊二醛液4 ℃下固定24 h后備用。將固定后的標(biāo)本行乙醇梯度脫水，每次10 min，空氣中干燥，真空純金鍍膜，SEM下觀察牙根面情況并拍攝圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，若服從正態(tài)分布，且各個(gè)樣本方差齊，則組間比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），若不服從，則進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或非參數(shù)統(tǒng)計(jì)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙根面形態(tài)的SEM觀察

SEM觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組（單純刮治）：?jiǎn)渭児沃挝唇?jīng)激光照射，可見(jiàn)明顯玷污層，有碎屑及菌斑樣物質(zhì)附著，牙根表面不平整，未見(jiàn)明顯裂隙、凹陷（圖1A）。激光1組（4 W）：根面出現(xiàn)明顯裂隙、凹陷，根面玷污層、碎屑及菌斑樣物質(zhì)減少（圖1B）。激光2組（6W）：根面有明顯裂隙，但無(wú)裂隙處較為平整，幾乎無(wú)玷污層，有極少量碎屑及菌斑樣物質(zhì)（圖1C）。激光3組（8 W）：根面可見(jiàn)明顯裂隙，有熔融、碎裂等熱傷害現(xiàn)象，有少量碎屑，幾乎未見(jiàn)玷污層及菌斑樣物質(zhì)（圖1D）。

圖1 不同處理組根面形態(tài) SEM × 5 000Fig 1 Root surfaces morphology in control and laser groups SEM × 5 000

2.2 變異鏈球菌黏附的比較

各組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且各樣本方差齊，因此各組的組間比較采用方差分析。不同處理組變異鏈球菌的黏附量見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組變異鏈球菌黏附量的比較 Fig 2 Comparison of Streptococcus mutans adhesion among con- trol and laser groups

激光1、2、3組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可以認(rèn)為各激光組變異鏈球菌的黏附量較對(duì)照組少；而不同功率激光組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 變異鏈球菌黏附的SEM觀察

選擇激光2組（6 W）作為激光組代表，進(jìn)行細(xì)菌黏附的SEM觀察，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理后的細(xì)菌黏附情況 SEM × 20 000Fig 3 Bacteria adhesion in different treatments SEM × 20 000

對(duì)照組可見(jiàn)有大量細(xì)菌黏附于牙根表面（圖3左）；激光2組可見(jiàn)有一定數(shù)量的細(xì)菌黏附于牙根表面，主要黏附于裂隙處，而其他相對(duì)較平整的牙根表面少見(jiàn)細(xì)菌黏附，黏附的細(xì)菌數(shù)量明顯少于對(duì)照組（圖3右）。

3 討論

牙周病治療的主要目的是去除菌斑、牙石，平整根面，促進(jìn)牙周再附著的形成。手用器械刮治作為目前常用的基礎(chǔ)治療手段尚存在一些缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)操作敏感性高，根分叉處器械無(wú)法到達(dá)，患者在接受治療時(shí)會(huì)產(chǎn)生不適感，術(shù)后有牙齒敏感等癥狀[12]；此外，單純刮治還會(huì)在牙根表面形成劃痕、玷污層等[11]。相比于傳統(tǒng)治療手段，Nd: YAG激光操作簡(jiǎn)單方便，在殺菌、去除玷污層、氣化牙結(jié)石、緩解牙本質(zhì)敏感等方面具有獨(dú)特的功能[3-4]，但有關(guān)激光在使用時(shí)具體的參數(shù)設(shè)置及安全性等問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。Slot等[5]用4 W的輸出功率探入牙周袋內(nèi)照射 60 s，測(cè)得細(xì)菌較治療前顯著減少；Qadri等[6]發(fā)現(xiàn)，手工刮治后輔助使用功率為4 W的激光照射治療牙周病，效果優(yōu)于單獨(dú)刮治治療；Kranendonk等[7]研究證明，牙周致病菌在功率為6 W的Nd: YAG激光照射15 s后顯著減少，照射30 s和45 s后無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；Ga?pirc等[13]采用Nd: YAG激光照射根面，牙根表面出現(xiàn)了裂縫、火山口及熔融碎裂等現(xiàn)象。激光的參數(shù)設(shè)置決定了激光的能量，從而影響激光的治療效果。當(dāng)生物物質(zhì)一定時(shí)，激光與生物物質(zhì)相互作用的效應(yīng)取決于光斑大?。ㄕ丈渚嚯x及角度）、激光功率和照射時(shí)間[14]。本實(shí)驗(yàn)選擇易于控制及調(diào)節(jié)的激光功率作為實(shí)驗(yàn)變量進(jìn)行研究，研究Nd: YAG激光對(duì)根面結(jié)構(gòu)及細(xì)菌黏附的影響。

本實(shí)驗(yàn)將單純刮治的對(duì)照組及經(jīng)過(guò)不同功率設(shè)置的激光處理后的牙根面進(jìn)行SEM觀察，可以發(fā)現(xiàn)激光處理后的牙根面玷污層、碎屑及菌斑樣物質(zhì)附著明顯少于單純刮治組，但激光組表面有明顯的裂隙、凹陷以及熔融碎裂等現(xiàn)象。該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研究基本一致，原因主要在于激光去除玷污層的同時(shí)會(huì)對(duì)牙面造成熱傷害[13]。本實(shí)驗(yàn)采用的是水冷Nd: YAG激光，可在一定程度上降低激光對(duì)根面的熱傷害，也可能是由于激光的熱效應(yīng)使表面附著的玷污層氣化，進(jìn)而使器械造成的根面劃痕、裂隙等更明顯地暴露出來(lái)所致[15]。此外，激光組中輸出功率為6 W的組較4 W及8 W組的根面形態(tài)相對(duì)更為平整，與4 W組相比，玷污層、碎屑及菌斑樣物質(zhì)減少，而8 W組有更為明顯的裂隙，甚至表面還出現(xiàn)了明顯的熔融、碎裂等牙骨質(zhì)損傷現(xiàn)象。由這些結(jié)果可得出本實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)論：牙根表面進(jìn)行單純刮治治療后，用波長(zhǎng)為1 064 nm，輸出功率分別為4、6、8 W的水冷Nd: YAG激光照射60 s，6 W組既能夠較好地去除牙根表面的玷污層和碎屑等物質(zhì)，又能較好地控制激光對(duì)根面的熱損害程度；但仍需要進(jìn)一步研究減少根面損傷程度的激光參數(shù)設(shè)置，如照射時(shí)間、距離、角度等。此外還需注意的是，口腔內(nèi)存在再礦化等因素，根面的表面結(jié)構(gòu)改變或許并不如實(shí)驗(yàn)中明顯。

變異鏈球菌作為口腔主要的致齲菌，對(duì)唾液獲得性膜的黏附是其致齲的重要基礎(chǔ)。牙體表面細(xì)菌的黏附受多種因素的影響，黏附機(jī)制十分復(fù)雜。研究表明[16-18]，細(xì)菌對(duì)牙面的黏附取決于牙面的粗糙度、表面自由能、電荷性及疏水性等因素的共同作用。變異鏈球菌的初始黏附是非蔗糖依賴性黏附，可能也包括黏附素-受體作用、靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等[2]，但其具體機(jī)制至今尚不完全清楚。如何有效減少牙周病治療后變異鏈球菌對(duì)牙根表面的黏附，從而減少牙周病的復(fù)發(fā)及根面齲的發(fā)生對(duì)臨床治療具有重要意義。目前關(guān)于激光對(duì)牙根表面的作用及影響細(xì)菌在牙面的初始黏附還少有研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)激光處理后的牙面變異鏈球菌的黏附量較單純刮治組明顯減少，從SEM中可以看出，變異鏈球菌主要黏附于裂隙處，而其他相對(duì)較平整的牙根表面較少見(jiàn)。一方面可能是由于細(xì)菌的黏附量是由多種因素共同決定的，激光處理會(huì)使牙根表面自由能、表面疏水性等其他特征參數(shù)也發(fā)生變化，這些因素協(xié)同作用使細(xì)菌的黏附量減少。研究[13,19-21]證實(shí)，激光能夠改變牙面的電荷分布、晶體結(jié)構(gòu)、氫鍵鍵能、電磁效應(yīng)，使組織結(jié)構(gòu)發(fā)生化學(xué)變化。另一方面，口腔硬組織以及口腔修復(fù)材料的表面粗糙度對(duì)細(xì)菌的最初黏附與滯留有著重要的作用，但其黏附量與粗糙度并非完全呈正相關(guān)。Quirynen等[16]發(fā)現(xiàn)，菌斑的黏附與表面自由能沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)，而表面粗糙度對(duì)齦下菌斑的黏附也沒(méi)有明顯影響，齦溝的環(huán)境對(duì)細(xì)菌黏附的影響可能更為重要。此外，細(xì)菌的黏附情況還與細(xì)菌種類有關(guān)，Yamauchi等[22]的實(shí)驗(yàn)表明，變異鏈球菌在粗糙表面比光滑表面的黏附量要少，而其他一些細(xì)菌如中間普氏菌在粗糙面的黏附量更多。Eick等[23]的研究則表明，變異鏈球菌的菌落數(shù)量與材料表面的粗糙度無(wú)明顯關(guān)系，其黏附量取決于細(xì)菌活力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，雖然激光造成了牙根表面裂隙增多，但激光處理的綜合效應(yīng)可使細(xì)菌在牙根表面的黏附量明顯減少。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)變異鏈球菌，尚未考慮口腔內(nèi)其他細(xì)菌及復(fù)雜環(huán)境的影響，而有關(guān)激光對(duì)牙周袋內(nèi)環(huán)境、齦下菌斑的構(gòu)成以及炎癥因子的改變等尚需深入研究。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）

Effects of Nd: YAG laser irradiation on the root surfaces and adhesion of Streptococcus mutans

Li Yuanhong, Li Zhongcheng, Luo Mengqi, Shen Daonan, Zhang Shu, Meng Shu. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Periodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Correspondence: Meng Shu, E-mail: dreamingue@163.com.

Objective This study aimed to evaluate the effects of treatment with different powers of Nd: YAG laser irradiation on root surfaces and Streptococcus mutans (S. mutans) adhesion. Methods Extracted teeth because of severe periodontal disease were divided into the following four groups: control group, laser group 1, laser group 2, and laser group 3. After scaling and root planning, laser group 1, laser group 2, and laser group 3 were separately treated with Nd: YAG laser irradiation (4/6/8 W, 60 s); however, the control group did not receive the treatment. Scanning electron microscopy (SEM) was used to determine the morphology. S. mutans were cultured with root slices from each group. Colony forming unit per mL (CFU·mL-1) was used to count and compare the amounts of bacteria adhesion among groups. SEM was used to observe the difference of bacteria adhesion to root surfaces between control group (scaling) and laser group 2 (6 W, 60 s), thereby indicating the different bacteria adhesions because of different treatments. Results Morphology alterations indicated that root surfaces in control group contain obvious smear layer, debris, and biofilm; whereas the root surfaces in laser group contain more cracks with less smear layer and debris. The bacteria counting indicated that S. mutans adhesion to laser group was weaker than that of control group (P<0.05). No statistical significance among the laser groups (P>0.05) was observed. Morphology alterations also verified that S. mutans adhesion to laser group 2 (6 W, 60 s) was weaker than that of control group (scaling). Conclusion This study demonstrated that Nd: YAG laser irradiation treatment after scaling can reduce smear layer, debris, and biofilm on the root surfaces as compared with conventional scaling. The laser treatment reduces the adhesion of S. mutans as well. However, Nd: YAG laser irradiation can cause cracks on the root surfaces. In this experiment, the optimum laser power of 6 W can thoroughly remove the smear layer and debris, as well as relatively improve the control of thermal damagee.

Nd: YAG laser; Streptococcus mutans; root surfaces

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2016.06.006

2016-04-11；

2016-09-02

李圓紅，學(xué)士，E-mail：1163370956@qq.com

孟姝，副教授，博士，E-mail：dreamingue@163.com