IGF信號(hào)軸在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換及預(yù)防卵巢癌復(fù)發(fā)中的作用

郭欣，張科科，劉燕，徐慧，蔡云朗

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

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·論 著·

IGF信號(hào)軸在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換及預(yù)防卵巢癌復(fù)發(fā)中的作用

郭欣1，張科科1，劉燕1，徐慧1，蔡云朗2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

目的:探究胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)軸在促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和抗凋亡中的作用，探討基于IGF信號(hào)軸的IGF-1R抑制劑的靶向治療和尋求降低卵巢癌化療后復(fù)發(fā)的可能途徑。方法：采用CD117+CD44+A2780卵巢癌細(xì)胞株，使用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)IGF信號(hào)軸中IGF-1、IGF-2和IGF-1R在CD117+CD44+A2780細(xì)胞中的表達(dá)；利用MTT法檢測(cè)IGF-1對(duì)CD117+CD44+A2780細(xì)胞的促增殖活性，配制IGF-1的質(zhì)量濃度分別為10、25、40、55 ng·ml-1,另設(shè)空白對(duì)照，從中篩選出加入外源IGF-1的適宜質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中；再將實(shí)驗(yàn)分為3組，即IGF-1刺激組、NVP抑制組和空白組。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞在藥物處理48 h后的細(xì)胞周期分布和凋亡率情況。結(jié)果：IGF信號(hào)軸組件IGF-1、IGF-2和IGF-1R均表達(dá)在CD117+CD44+A2780細(xì)胞的細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中；MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源IGF-1質(zhì)量濃度為40 ng·ml-1時(shí)對(duì)CD117+CD44+A2780細(xì)胞的促分裂增殖作用最明顯；IGF-1刺激組較空白組增殖明顯活躍，凋亡率降低(P<0.05)；NVP抑制組較空白組增殖明顯減少，凋亡率增高(P<0.05)。結(jié)論：IGF信號(hào)軸與卵巢癌化療后的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，IGF-1在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換增殖狀態(tài)和對(duì)抗凋亡中發(fā)揮著重要作用；NVP阻斷IGF-1R的作用可有效抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞從休眠狀態(tài)啟動(dòng)分裂增殖；IGF信號(hào)軸組件可作為卵巢癌治療及化療后預(yù)防復(fù)發(fā)的靶點(diǎn)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體；NVP-AEW541；卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞

卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其早中期無(wú)特異性的臨床表現(xiàn)，明顯影響了對(duì)卵巢癌的早期診斷，多數(shù)患者錯(cuò)失了治療的時(shí)機(jī)。早期診斷、盡量減滅腫瘤細(xì)胞及防止復(fù)發(fā)是治療卵巢癌的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是一類具有較強(qiáng)耐藥性細(xì)胞，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、促血管生成和復(fù)發(fā)的根源。在臨床治療中，經(jīng)過(guò)理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和足量合理的化療后，絕大部分的腫瘤細(xì)胞被殺死，殘留癌細(xì)胞中的CSCs處于一種靜止?fàn)顟B(tài)，不表現(xiàn)出活躍的分裂增殖現(xiàn)象，患者會(huì)出現(xiàn)相對(duì)較長(zhǎng)的緩解期。但臨床化療可使腫瘤干細(xì)胞濃集，當(dāng)受到適當(dāng)?shù)拇碳た稍俅芜M(jìn)入活躍增殖狀態(tài)[1]。CSCs逸出靜止期進(jìn)入增殖狀態(tài)導(dǎo)致完全緩解期后腫瘤的復(fù)發(fā)，并且復(fù)發(fā)的腫瘤相比初發(fā)腫瘤具有更強(qiáng)的耐藥性和侵襲性。因此，探究腫瘤干細(xì)胞的增殖凋亡及與其增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換相關(guān)的因素是腫瘤治療的關(guān)鍵。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)可特異性結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor receptor，IGF-1R)。IGF-1R是一種異源二聚體跨膜蛋白酪氨酸激酶，與配體IGF-1、IGF-2結(jié)合后使IGF-1R的酪氨酸殘基磷酸化，激活多條信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及抗凋亡。IGF信號(hào)軸在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，研究IGF軸在CSCs增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換中的作用，對(duì)于尋找新的化療藥物靶點(diǎn)、提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性具有重要意義。本次實(shí)驗(yàn)選用具有卵巢癌干細(xì)胞特性的CD117+CD44+A2780細(xì)胞株[2]，進(jìn)一步探究IGF信號(hào)軸促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞逸出靜止期、抗凋亡的機(jī)制，探討降低卵巢癌復(fù)發(fā)率的可能途徑。

1 試劑與方法

1.1 主要試劑

鼠抗IGF-1單克隆抗體、鼠抗IGF-2單克隆抗體、鼠抗IGF-1R多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。NVP-AEW541(以下簡(jiǎn)稱NVP)是吡咯并嘧啶類化合物，作為IGF-1R的抑制劑，阻斷胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，購(gòu)自美國(guó)Cayman生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD117+CD44+A2780細(xì)胞，將細(xì)胞置37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中4～5 d傳代1次。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定IGF軸 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CD117+CD44+A2780細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞，接種于6孔板上，培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁之后更換為新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，48 h后終止培養(yǎng)。浸入4%的多聚甲醛固定液中30 min，PBS浸洗3 min×3次；每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫(15～25 ℃)封閉10 min，PBS浸洗3次；滴加即用型山羊血清50～100 μl，室溫孵育20 min；滴加一抗(1∶200稀釋)50～100 μl，于37 ℃濕盒孵育2 h，PBS浸洗3次；滴加增強(qiáng)劑50 μl，室溫濕盒孵育30 min，PBS浸洗3次；滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μl，室溫37 ℃，孵育30 min，PBS浸洗3次。每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液顯色，終止顯色后將切片放入蘇木素染液，染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈；脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞中IGF1、IGF2、IGF-1R的表達(dá)情況，取3個(gè)區(qū)域拍照保存。

1.2.3 篩選外源IGF-1適宜濃度 將細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板上，完全培養(yǎng)基孵育過(guò)夜，更換為新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入IGF-1，質(zhì)量濃度分別為10、25、40、55 ng·ml-1。IGF-1作用24 h后倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔板上，根據(jù)不同的處理方式將細(xì)胞分為未加IGF-1的空白組、加IGF-1的刺激組和加NVP的抑制組(10 μmol·L-1)。其中IGF-1刺激組的IGF-1質(zhì)量濃度根據(jù)1.2.3的結(jié)果進(jìn)行選擇。藥物作用48 h后各組離心收集5×105個(gè)細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于6孔板上，按同樣的方法分組，藥物作用48 h后各組離心收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 CD117+CD44+A2780細(xì)胞IGF-1、IGF-2、IGF-1R的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示，IGF-1、IGF-2、IGF-1R在CD117+CD44+A2780細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上均有表達(dá)，呈棕色顆粒(圖1)。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)IGF-1、IGF-2、IGF-1R在CD117+CD44+A2780細(xì)胞中的表達(dá)(×400)

2.2 篩選外源IGF-1的適宜濃度

加入不同質(zhì)量濃度的IGF-1，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)提示低濃度的IGF-1即可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并隨著濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用就越強(qiáng)。當(dāng)IGF-1的質(zhì)量濃度達(dá)到40 ng·ml-1時(shí)，與空白組和25 ng·ml-1IGF-1刺激組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)IGF-1的質(zhì)量濃度增加至55 ng·ml-1時(shí)，與空白組間細(xì)胞增殖的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與40 ng·ml-1IGF-1刺激組組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，所以IGF-1刺激組加入的外源IGF-1質(zhì)量濃度選用40 ng·ml-1，見(jiàn)表1。

2.3 CD117+CD44+A2780細(xì)胞的周期和凋亡

細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，IGF-1刺激組與空白組相比，IGF-1刺激組G1期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，S期的細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，G2期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)；NVP抑制組與空白組相比，G1期的細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，S期的細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，G2期的細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表1 外源IGF-1對(duì)CD117+CD44+A2780細(xì)胞的促增殖作用

組 別細(xì)胞計(jì)數(shù)/(×105)OD值10ng·ml-1IGF-1組2.50±0.06a0.420±0.04a25ng·ml-1IGF-1組3.13±0.05a0.479±0.08a40ng·ml-1IGF-1組3.89±0.17a0.563±0.05a55ng·ml-1IGF-1組3.92±0.25a0.567±0.15a空白對(duì)照組2.20±0.270.327±0.08

與空白對(duì)照組相比，aP<0.05

表2 CD117+CD44+A2780細(xì)胞周期分布

組 別nG1期S期G2期IGF-1刺激組836.19±1.30a56.51±1.45a7.30±0.55a空白對(duì)照852.49±0.3737.85±0.569.67±0.63NVP抑制組849.03±0.70ab40.64±0.65ab10.33±0.37ab

與空白組相比,aP<0.05; 與IGF-1刺激組相比,bP<0.05

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)CD117+CD44+A2780細(xì)胞在48 h的凋亡率空白組和IGF-1刺激組分別為(8.38±0.25)%、(6.53±0.36)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NVP抑制組的凋亡率為(32.79±0.34)%，與空白組和IGF-1刺激組的相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3 討 論

IGF軸組件表達(dá)于正常的卵巢上皮和卵巢上皮性癌組織，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、分化及凋亡。越來(lái)越多的研究表明IGF信號(hào)軸與癌變有關(guān)[3]，腫瘤組織中IGF-1的含量可作為卵巢癌進(jìn)展相關(guān)的獨(dú)立因素，IGF軸在調(diào)節(jié)卵巢癌腫瘤的增殖和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用[4-5]，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。目前研究已經(jīng)證實(shí)IGF-1R在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌和結(jié)腸癌等，血漿中IGF-1的含量與患乳腺癌、前列腺癌和肺癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且IGF-1R的表達(dá)量可預(yù)示乳腺癌的結(jié)果[6-8]。進(jìn)一步研究表明在肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌及膀胱癌的腫瘤組織中降低IGF-1R的表達(dá)量，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9-11]。IGF軸的作用依賴于IGF-1和IGF-1R結(jié)合，不僅促進(jìn)細(xì)胞合成分泌IGF-1和IGF-2，而且存在IGF的自分泌調(diào)節(jié)，促使細(xì)胞合成更多的IGF-1R，IGF-1R表達(dá)量的增加同時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分泌更多的IGF-1和IGF-2[12]。IGF-1、IGF-2與IGF-1R特異性地結(jié)合后，其激活的通路主要有絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt-1)途徑，起主要作用的是PI3K/AKT通路[13]。PI3K/AKT信號(hào)通路作為一條經(jīng)典的生物學(xué)通路，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，傳遞生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活導(dǎo)致其下游細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)的異常高表達(dá)，CyclinB1過(guò)度表達(dá)可促使細(xì)胞的G2/M期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞的增生失控和惡性轉(zhuǎn)換。

本實(shí)驗(yàn)用不同質(zhì)量濃度的外源IGF-1作用于細(xì)胞，在低質(zhì)量濃度時(shí)即可發(fā)揮促增殖的作用，在一定范圍內(nèi)增加質(zhì)量濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，IGF-1的促增殖效果也會(huì)增強(qiáng)。IGF-1作用48 h后，CD117+CD44+A2780細(xì)胞活躍增殖。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖明顯時(shí)致腫瘤復(fù)發(fā)臨床緩解期結(jié)束。復(fù)發(fā)瘤較初發(fā)瘤普遍具有更強(qiáng)的耐藥性，阻斷由CSCs增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)是目前針對(duì)CSCs腫瘤化療的新策略。IGF-1、IGF-2發(fā)揮作用需要通過(guò)IGF-1R受體，對(duì)于IGF-1R的靶向治療可能會(huì)延長(zhǎng)患者的完全緩解期，阻斷CSCs逸出靜止期，降低腫瘤復(fù)發(fā)率。采用針對(duì)IGF軸的阻斷劑如IGF-1R的單克隆抗體、配體抗體或酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)輔助化療可增強(qiáng)化療效果。針對(duì)IGF-1R的單克隆抗體和TKIs進(jìn)行的大量在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不統(tǒng)一[14]，可能與IGF-1R阻斷劑在體內(nèi)不能維持IGF-1R的下調(diào)或?qū)I3K-AKT通路的抑制有關(guān)，提示腫瘤微環(huán)境對(duì)于這些因子的作用效果起到重要作用。

IGF-1R在體內(nèi)外均可有抗凋亡的作用，且IGF-1R表達(dá)率高的細(xì)胞其生存率也就越高[15]。NVP不僅阻斷胞內(nèi)信號(hào)傳遞，明顯減弱活化AKT的抗凋亡作用，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞表型。在臨床緩解期，CSCs可以長(zhǎng)期存在，與IGF-1的抗凋亡作用有關(guān)。NVP抑制IGF-1R后CD117+CD44+A2780細(xì)胞顯著凋亡，表示阻斷IGF-1R的作用后，卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞抗凋亡的機(jī)制被破壞，凋亡率增加，減低腫瘤復(fù)發(fā)率。

綜上所述，IGF信號(hào)軸在阻斷腫瘤干細(xì)胞增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換、抗凋亡和抑制腫瘤復(fù)發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，已成為治療腫瘤的特異性靶點(diǎn)。近年來(lái)，針對(duì)IGF信號(hào)軸各組件的抑制劑已是抗腫瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，傳統(tǒng)化療藥物和IGF-1R抑制劑聯(lián)用可增強(qiáng)化療效果。探究針對(duì)IGF-1R的靶向藥物，為腫瘤干細(xì)胞的治療提供新的方案，將具有重要的臨床意義。

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The role of IGF signal axis in proliferation transformation of ovarian cancer stem cell-like cells and in prevention of recurrent ovarian cancer

GUO Xin1，ZHANG Ke-ke1，LIU Yan1，XU Hui1，CAI Yun-lang2

(1.MedicalCollege，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To explore the role of IGF signal axis in promoting cell proliferation and anti-apoptosis of CD117+CD44+A2780，the ovarian cancer stem cell-like cells，discussing the targeting therapy based on IGF signal axis of IGF-1R and looking for possible ways to reduce the recurrence of ovarian cancer after chemotherapy.Materials and Methods： This experiment used CD117+CD44+A2780 ovarian cancer cell line，the expression of IGF-1，IGF-2 and IGF-1R of IGF signal axis in CD117+CD44+A2780 were detected by immune histochemical method; cells proliferation which was promoted by IGF-1 was measured by MTT assay in CD117+CD44+A2780，the concentration of IGF-1 was respectively 10，25，40，55 ng·ml-1and blank group.The suitable concentration of IGF-1 was selected and used in subsequent experiment; then the experiment was divided into three group： IGF-1 stimulate group，NVP inhibit group and blank group，the cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry after 48 h drug treatment.Results： IGF-1，IGF-2 and IGF-1R of IGF signal axis expressed in CD117+CD44+A2780’s cell membrane and cytoplasm; MTT test experimented on CD117+CD44+A2780 selected the suitable concentration of the four group of exogenous IGF-1，with a concentration of 40 ng·ml-1obviously promoting the proliferation; flow cytometry showed more active proliferation and a decreased apoptosis rate in IGF-1 stimulating group compared with the blank group(P<0.05); NVP inhibiting group，compared with blank group，inhibited proliferation and increased apoptosis rate(P<0.05).Conclusion： IGF signal axis has close relationship with the recurrence of ovarian cancer after chemotherapy; IGF-1 plays an important role in transforming the state of proliferation and anti-apoptosis; NVP can block the effect of IGF-1，stop ovarian cancer stem cell-like cells transforming from quiescent state to growth state; IGF axis can be used as target proteins in ovarian cancer treatment and prevention of recurrence after chemotherapy．

insulin-like growth factor-1；insulin-like growth factor-1 receptor；NVP-AEW541；ovarian cancer stem cell-like cells

2016-03-01

2016-05-09

郭欣(1991-)，女，山東聊城人，在讀碩士研究生。E-mail：15905172950@163.com

蔡云朗 E-mail：ylseu63@sohu.com

郭欣，張科科，劉燕，等.IGF信號(hào)軸在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)換及預(yù)防卵巢癌復(fù)發(fā)中的作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：736-741.

R737.31

A

1671-6264(2016)05-0736-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．019