新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細胞水平的相關性研究

張園，馮陽春，黃艷春

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 1.腫瘤防治研究所，2.檢驗科，新疆 烏魯木齊 830011)

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·論 著·

新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細胞水平的相關性研究

張園1，馮陽春2，黃艷春2

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 1.腫瘤防治研究所，2.檢驗科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的:檢測新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況及外周血中Th17細胞比例，探討HPV感染與Th17細胞表達的關系。方法:采用二代雜交捕獲法及流式細胞術分別檢測宮頸癌組(維吾爾族50例)、正常對照組(維吾爾族50例)的HPV感染狀況和外周血中Th17細胞比例。結果:維吾爾族宮頸癌組HPV檢出率96.0%，正常對照組HPV檢出率為6.0%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量差異有統計學意義(P<0.05)，且隨宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒載量越高。維吾爾族宮頸癌組患者外周血Th17細胞占淋巴細胞的比例較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Th17細胞水平在HPV陽性與陰性組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨HPV載量的升高，Th17細胞表達水平也升高，兩者呈正相關(r=0.55，P<0.001)；外周血Th17細胞表達水平與FIGO分期、是否有淋巴結轉移、脈管浸潤均呈正相關(r值分別為0.75、0.59、0.62，均P<0.001)。結論:Th17細胞在HPV持續感染所致宮頸癌的發生發展中可能起著重要作用。

宮頸癌；Th17細胞；人乳頭瘤病毒；維吾爾族

宮頸癌(cervical cancer)是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，而在新疆地區維吾爾族宮頸癌發病率顯著高于該地區其他民族[1]。超過90%的宮頸癌患者人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)檢測均為陽性。在HPV病毒持續感染及其他多種因素的協同作用下，宮頸鱗狀上皮細胞的免疫機制遭到破壞。因此，宮頸癌患者體內免疫微環境的變化在疾病的發生發展過程中起了重要的作用[2]。Th17(T helper 17)細胞是一種能特異性地產生IL-17(interleukin 17，IL-17)的新型CD4+T細胞。Th17細胞在對抗惡性腫瘤、自身免疫性疾病和移植物抗宿主等疾病中起到保護性免疫應答作用，且IL-17的水平與多種疾病預后和轉歸相關[3-4]。

本實驗旨在通過研究新疆維吾爾族宮頸癌患者HPV感染狀況及外周血Th17細胞表達水平，探討兩者的關系及其在宮頸癌發生、發展中的作用和意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

宮頸癌組：2014年1月至12月于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦科住院的維吾爾族宮頸癌患者50例，所有患者術前均未經化療、放射或生物治療，均有明確病理分型及臨床分期(FIGO)。術前無菌采集外周血3 ml加肝素抗凝；根據宮頸癌FIGO分期將患者分為Ⅰ期患者11例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者15例，Ⅳ期患者10例。

對照組：選取維吾爾族健康體檢者50例作為對照，對照組年齡與宮頸癌組匹配。所有研究對象均無自身免疫性疾病史，無傳染病史以及其他種類惡性腫瘤。

1.2 主要試劑和設備

采用HC2-HPV-DNA基因雜交信號放大系統檢測HPV，儀器及試劑均為美國Digene公司產品；流式細胞儀FC500，美國Beckman Coulter公司產品；抗IL-17A-PE/Cy7，美國BioLegend產品；抗CD4-PC5，美國Beckman Coulter產品；Leukocyte Activation Cocktail，美國BD公司產品；固定破膜劑試劑盒，eBioscience公司產品；RPMI-1640培養基，Gibco產品；小牛血清，杭州四季青生物公司產品。

1.3 方法

1.3.1 HPV檢測 使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口鱗、柱狀上皮交界處采集標本。利用基因雜交、化學發光、信號放大的原理，在分子水平上檢測被WHO確認的13種高危型HPV(HR-HPV)病毒DNA。標本檢測結果以光量讀數與標準陽性測定值比值(RLU/PC)報告，以試劑盒內附的參考值為判斷標準，即RLU/PC>1時，高危型HPV陽性，反之則為陰性，RLU/PC數值越高表示標本所含病毒載量越高。將HR-HPV病毒載量分為4組，低載量1～<10；中低載量10～<100；中高載量100～<1 000；高載量≥1 000。

1.3.2 采用流式細胞術檢測外周血Th17細胞水平 在無菌試管中加入200μl肝素鈉抗凝全血，再加入等量1 640培養基(含小牛血清)混勻，加入2μl白細胞活化混合物(leukocyte activation cocktail)，37℃、體積分數5% CO2刺激培養4～6 h(每隔2 h混勻1次)，加入10μl CD4-PC5及同型對照進行細胞表面分子染色，加入溶血素500μl混勻室溫避光10min，PBS洗滌棄上清，經固定和破膜后加入20μl IL-17-PC7抗體及同型對照進行胞內抗體染色，室溫孵育30 min，加入500μl PBS重懸細胞，上機檢測。Th17細胞水平以CD4+IL-17+表示。

1.4 統計學處理

應用SPSS 18.0進行統計學處理，計量資料用均數±標準差表示，多組組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，對宮頸癌組中不同期別的HPV DNA病毒載量均數行Kruskal-Wallis檢驗，相關系數采用Spearman分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HPV檢出率的比較

正常對照組50例，HPV陽性3例，HPV感染陽性率為6.0%(3/50)；宮頸癌組50例，HPV陽性48例，HPV感染陽性率為96.0%(48/50)。兩組HPV檢出率差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 HPV病毒載量與宮頸病變分期的關系

宮頸癌患者中HPV DNA病毒載量均數在Ⅰ期組中為302.09，Ⅱ期組中為424.22，Ⅲ期組中為619.67，Ⅳ期組中為704.12，對宮頸癌組中不同期別的HPV DNA病毒載量均數進行秩和檢驗，不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量差異有統計學意義(Hc=7.99，P<0.05)，且隨宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒載量越高。宮頸癌的FIGO分期期別越高，HPV病毒在較高的載量范圍所占百分比越高，HPV DNA病毒載量在宮頸癌Ⅰ期組中有36.4%在中高度載量以上，在宮頸癌Ⅱ期組中有50%在中高度載量以上，在宮頸癌Ⅲ期組有73.3%在中高度載量以上，Ⅳ期組有80%在中高度載量以上。見表1。

表1 不同期別的宮頸癌的HPV病毒載量分布情況 例

Tab 1 Distribution of HPV viral load in different stage cervical cancer cases

注：括號內為所占百分比

2.3 兩組外周血中Th17細胞水平比較

50例宮頸癌患者外周血Th17細胞水平為(2.05±0.48)%，50例正常對照者外周血Th17水平為(0.90±0.28)%；宮頸癌組外周血Th17細胞水平明顯高于正常對照組，兩組間差異具有統計學意義(t=14.49，P<0.001)。見圖1。

2.4 宮頸癌病理學特征與外周血中Th17細胞水平間的關系

宮頸癌患者外周血中Th17細胞水平與FIGO分期、HPV病毒感染載量高低及是否有淋巴結轉移、脈管浸潤有關(均P<0.001)。宮頸癌患者外周血Th17細胞水平與FIGO分期呈正相關(r=0.75，P<0.001)；與HPV病毒載量呈正相關(r=0.55，P<0.001)，有淋巴結轉移組及有脈管浸潤組Th17細胞表達水平顯著高于無淋巴結轉移組及無脈管浸潤組，差異有統計學意義(P<0.001)，外周血Th17細胞水平與是否有淋巴結轉移、脈管浸潤呈正相關(r值為0.59、0.62，P<0.001)。見表2。

2.5 HPV陰性與陽性者外周血中Th17細胞水平比較

HPV陽性組(正常對照組中HPV感染3例，宮頸癌組中HPV感染48例)外周血Th17細胞水平為(2.02±0.51)%，HPV陰性組外周血Th17水平為(0.90±0.29)%，兩組間差異具有統計學意義(t=13.43,P<0.001)。

3 討 論

新疆是我國宮頸癌高發區，尤其在南疆宮頸癌是當地維吾爾族婦女疾病死亡的主要原因之一。高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌及癌前病變發生的重要危險因素之一。本研究結果顯示，宮頸癌組HPV檢出率明顯高于正常對照組，不同期別的宮頸癌患者HPV病毒載量差異有統計學意義，隨宮頸癌的FIGO分期期別的增高，HPV病毒載量也隨之升高，且宮頸癌患者HPV病毒載量普遍在中高度載量范圍，進一步證實了高危HPV感染在新疆維吾爾族婦女宮頸癌的發生發展過程中起著不可忽視的作用。

圖1 兩組淋巴細胞比率和Th17細胞比率比較

Fig 1 Percentages of lymphocytes and Th17 cells in two groups

宮頸癌的發生是一個多因素、多階段、多步驟的過程，在HPV病毒持續感染及多種因素的共同作用下，宮頸鱗狀上皮細胞受到破壞，并誘導機體免疫調節平衡失調，宿主自身的免疫因素對疾病的發生發展起著決定性的作用。Th17細胞是輔助性T細胞新亞群，因能夠分泌白介素17(interleukin 17，IL-17)而得名，在自身免疫性疾病及機體防御反應中起到重要作用。目前在多種腫瘤，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、大腸癌、腎癌、非小細胞肺癌等[5-7]中發現Th17細胞及其分泌的細胞因子表達，但Th17細胞在腫瘤免疫中發揮的作用是抗腫瘤，還是促進腫瘤發展，目前仍然結論不一。

本研究中維吾爾族宮頸癌患者外周血中Th17細胞水平顯著高于維吾爾族健康對照組。外周血Th17細胞水平與宮頸癌FIGO分期、淋巴結轉移、脈管浸潤有關，隨臨床分期加重而表達升高。提示Th17細胞的表達隨著宮頸癌惡性程度增加而升高，在宮頸癌發生發展過程中表現為促進腫瘤生長的作用。Th17細胞可能是通過與效應性細胞相互作用、誘導機體發生腫瘤免疫監視逃逸及促進腫瘤血管上皮細胞生成等機制參與腫瘤的發生發展。Numasaki等[8]研究發現，通過轉染IL-17至非小細胞肺癌腫瘤細胞中，并將此細胞種植到SCID小鼠體內，結果發現IL-17選擇性增強血管生成趨化因子的分泌，促進腫瘤血管分布，加速腫瘤的生長、浸潤及轉移。此外，有研究發現IL-17通過改變腫瘤細胞的行為和誘發腫瘤發生的中性粒細胞招募促進乳腺腫瘤進展[9]。結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的研究結果[9-10]顯示，Th17細胞和IL-17表達水平與患者的預后有關，Th17細胞水平的升高導致患者死亡率升高、生存期縮短、疾病預后較差。

在丙型肝炎病毒感染后的病毒清除過程中特異性Th17細胞發揮了一定作用[11]。關于Th17細胞水平與宮頸癌發生發展關系的研究并不多見，而從Th17細胞水平與HPV感染為研究視角，在新疆維吾爾族宮頸癌患者中研究的尚未見相關報道。本研究顯示Th17細胞水平與高危型HPV之間的關系密切，Th17細胞水平HPV陽性組顯著高于HPV陰性組，并且隨HPV病毒載量的升高，Th17細胞水平也升高，兩者呈正相關，提示Th17細胞可能參與清除HPV病毒的作用，HPV載量越高其對細胞因子的調節作用越顯著，但HPV病毒如何誘導Th17細胞產生免疫應答尚待進一步研究。腫瘤免疫機制復雜，尚須擴大樣本量進一步驗證此實驗結果在不同民族及地區宮頸癌發生發展的普遍性。

表2 宮頸癌患者外周血Th17細胞水平與臨床各項指標間的關系

Tab 2 Relationship between the levels of Th17 cells in peripheral blood and clinical indicators in cervical cancer patients

臨床指標nTh17細胞水平F或t值P值FIGO分期 Ⅰ111.47±0.2121.9620.000 Ⅱ142.02±0.27 Ⅲ152.14±0.29 Ⅳ102.58±0.48HPV病毒載量 低度載量31.48±0.346.3810.001 中度載量151.85±0.33 中高載量232.20±0.33 高度載量72.42±0.70分化程度 高分化131.86±0.41 中分化182.03±0.40 低分化192.20±0.562.0780.136淋巴結轉移 有242.32±0.484.5350.000 無261.80±0.32脈管浸潤 有242.33±0.464.9630.000 無261.78±0.31

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Correlation analysis of high-risk human papilloma virus viral load and the level of Th17 cells in peripheral blood in Uygur women with cervical cancer

ZHANG Yuan1，FENG Yang-chun2，HUANG Yan-chun2

(1.InstituteofTumorResearch，2.ClinicalLaboratoryDepartment，TumorHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective： To investigate the correlation between human papilloma virus(HPV) and Th17 cells in peripheral blood of Uygur patients with cervical cancer.Methods: Peripheral blood was collected from 50 cases of Uygur cervical cancer patients and 50 Uygur healthy people.Hybrid capture Ⅱ method was used to detect viral load of HPV.The percentage of Th17 cells was detected by flow cytometric analysis.Results: The rate of HR-HPV infection was 96.0% in the cervical cancer group，6.0% in healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells in cervical cancer group was significantly higher than that in the healthy control group(P<0.05).The percentages of Th17 cells between HPV positive and negative group was statistically significantly different(P<0.05).The expression of Th17 cells in peripheral blood was positively correlated with FIGO stage，lymph node metastasis，and vascular infiltration(r=0.55，0.59，0.62，P<0.001).Conclusion: Th17 cells may play an important role in the development of persistent HPV infection leading to cervical cancer．

cervical cancer；Th17 cell；human papilloma virus；Uygur

2016-03-02

2016-05-26

新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(2015211C133)；新疆醫科大學附屬腫瘤醫院科研啟動基金資助項目(腫2014-04)

張園(1982-)，女，河北保定人，助理研究員。E-mail:xj_zhangyuan@163.com

黃艷春 E-mail:huangyanchun0619@sohu.com

張園，馮陽春，黃艷春.新疆維吾爾族宮頸癌患者人乳頭瘤病毒感染與外周血中Th17細胞水平的相關性研究[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：699-703.

R737.33

A

1671-6264(2016)05-0699-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．011