HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實(shí)驗(yàn)研究

王璐，薛萌，殷鵬飛，樊飛，曹萌，王立新

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

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HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實(shí)驗(yàn)研究

王璐，薛萌，殷鵬飛，樊飛，曹萌，王立新

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

目的:探討轉(zhuǎn)染HBV基因組的HepG2.2.15細(xì)胞自噬小體(HBV+DRibbles)誘導(dǎo)HBV特異性免疫應(yīng)答及其對HBV急性感染的治療作用。方法：ELISA法檢測HBV+DRibbles體外再刺激HBsAg特異性效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平；對HBV急性感染模型小鼠實(shí)施HBV+DRibbles、HBV+DRibbles聯(lián)合DC免疫，ELISA法檢測HBV抗原及抗原肽刺激免疫小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的含量；ELISA法、熒光定量PCR法和酶法分別檢測小鼠血清HBeAg、HBV DNA、ALT和AST的水平；免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肝組織HBcAg表達(dá)及免疫病理損傷。結(jié)果：與培養(yǎng)液對照組和HBsAg蛋白刺激組相比，HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應(yīng)細(xì)胞能夠產(chǎn)生更高水平的IFN-γ(P=0.004)；與未負(fù)載抗原的DC細(xì)胞對照組和負(fù)載HBsAg的DC刺激組相比，DC負(fù)載HBV+DRibbles再刺激HBsAg特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞均能產(chǎn)生更高水平的IFN-γ(P<0.001)。與PBS對照組相比，HBV+DRibbles疫苗組和HBV+DRibbles聯(lián)合DC免疫組均能誘導(dǎo)HBV急性感染模型小鼠產(chǎn)生HBV特異性免疫應(yīng)答，明顯降低血清HBeAg、HBV DNA水平，減低HBcAg+肝細(xì)胞比例，而ALT及AST水平未見明顯差異，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常；但HBV+DRibbles疫苗組與HBV+DRibbles聯(lián)合DC免疫組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：HBV+DRibbles作為HBV抗原載體，能夠有效誘導(dǎo)DC對HBV抗原的交叉遞呈；HBV+DRibbles誘導(dǎo)的HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答對HBV急性感染具有一定的治療作用。

乙型肝炎；乙型肝炎病毒；自噬小體；治療性疫苗；小鼠

乙型肝炎病毒(HBV)感染危及全球人類健康，面對2.4億HBV慢性感染患者，目前尚無理想的治療性疫苗[1-2]。我們前期研究[3-5]顯示,腫瘤細(xì)胞來源自噬小體(DRibbles)是腫瘤抗原的有效載體，能刺激樹狀突細(xì)胞(DC)活化，交叉遞呈腫瘤抗原，誘導(dǎo)具有治療效果的抗腫瘤免疫應(yīng)答；而轉(zhuǎn)染HBV基因組的HepG2.2.15細(xì)胞自噬小體(HBV+DRibbles)中富含HBV抗原成分。本研究旨在進(jìn)一步探討HBV+DRibbles能否有效誘導(dǎo)DC交叉遞呈HBV抗原，從而誘導(dǎo)HBV特異性細(xì)胞應(yīng)答及其對HBV急性感染的治療作用，以期為臨床HBV感染治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。HepG2.2.15細(xì)胞為轉(zhuǎn)HBV全基因組人肝癌細(xì)胞,由本院張建瓊教授惠贈，pAAV/HBV1.2質(zhì)粒(1.2倍HBV基因組重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒)由臺灣大學(xué)陳培哲教授惠贈，F(xiàn)lt3-L質(zhì)粒、GM-CSF質(zhì)粒由美國波特蘭醫(yī)學(xué)中心胡紅明教授惠贈，硼替佐米(bortizomib)由中大醫(yī)院血液科丁家華主任惠贈,HBsAg純蛋白由南京市第二醫(yī)院周振先主任惠贈。雷帕霉素(rapamycin)購自廣州寶柏生物公司，NH4Cl購自南京創(chuàng)瑞生物公司，HBsAg重組疫苗購自江蘇省疾病控制中心，Dynabeads磁珠購自Dynal Biotech公司，HBcAg購自ProSpec公司，HBV肽由上海耀強(qiáng)生物有限公司合成，HBV DNA定量檢測試劑盒及HBV ELISA檢測試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司，RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，胎牛血清(FCS)購自Hyclone公司，Bradford蛋白定量試劑盒購自碧云天公司，小鼠IFN-γ檢測試劑盒購自eBioscience有限公司，兔抗人HBc-IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔多聚體、聯(lián)苯二胺購自中山金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞用含100 ml·L-1FCS、100 U·ml-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.2.2 HBV+DRibbles制備 取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞，加入硼替佐米、雷帕霉素、NH4Cl共孵育16～24 h，胰酶消化，取細(xì)胞及培養(yǎng)上清，以1 200 r·min-1離心10 min；取上清，4 ℃以12 000 r·min-1離心30 min；取沉淀，PBS重懸，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆肹3-5]。

1.2.3 HBV+DRibbles蛋白定量 按Bradford蛋白定量試劑盒說明書操作。

1.2.4 HBV+DRibbles中HBsAg定量 RIPA細(xì)胞裂解液裂解HBV+DRibbles，置冰上5～10 s，加等量PBS混勻，以10 000 r·min-1離心4 min，取上清。按“乙型肝炎表面抗原診斷試劑盒”說明書檢測HBsAg，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品蛋白含量。

1.2.5 小鼠血清HBV抗原及anti-HBs抗體檢測 按“乙型肝炎表面抗原及表面抗體診斷試劑盒”說明書檢測。

1.2.6 DC細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo) 對小鼠于第1天尾靜脈高壓注射法注射Flt3-L質(zhì)粒，5 μg·只-1；于第10天相同方法及劑量注射GM-CSF質(zhì)粒；第15天收獲小鼠脾細(xì)胞，以1 200 r·min-1離心10 min，取沉淀紅細(xì)胞裂解液裂解5 min；加PBS以1 200 r·min-1離心10 min；無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞至2×107ml-1，-196 ℃液氮凍存。

1.2.7 DC細(xì)胞交叉遞呈HBV抗原 重組HBsAg疫苗免疫小鼠：左下肢外側(cè)肌肉注射2 μg·只-1，隔天加強(qiáng)，共2次。免疫14 d后采血，分離血清，檢測HBsAb。取抗體陽性小鼠脾臟及淋巴結(jié)來源的淋巴細(xì)胞作為HBsAg特異性細(xì)胞，加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，終濃度2×106ml-1，分別用梯度稀釋的HBV+DRibbles、HBsAg蛋白(HBsAg:100、30、0 ng·ml-1；DRibbles:30、3、0 ng·ml-1，DRibbles劑量為其所含HBsAg量)再刺激，ELISA法檢測培養(yǎng)72 h后上清中IFN-γ含量。進(jìn)一步磁珠分選CD4+和CD8+T細(xì)胞，加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，終細(xì)胞濃度2×106ml-1；復(fù)蘇DC細(xì)胞，加入1 μg·ml-1LPS，同時分別加入30 ng HBsAg蛋白及含30 ng HBsAg的HBV+DRibbles，37 ℃共孵育6 h，取出;加PBS洗滌，以1 200 r·min-1離心10 min，共3次;將DC加入分選細(xì)胞板孔中，終細(xì)胞濃度1×106ml-1，ELISA法檢測培養(yǎng)72 h上清中IFN-γ的含量。

1.2.8 HBV+DRibbles單獨(dú)或聯(lián)合DC免疫誘導(dǎo)HBV特異性細(xì)胞應(yīng)答 小鼠尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒[6]，第3天按血清HBeAg水平配對分組，設(shè)PBS對照組、HBV+DRibbles疫苗組及HBV+DRibbles聯(lián)合DC(DRibbles+DC)免疫組。HBV+DRibbles疫苗組：于質(zhì)粒注射后第3天，HBV+DRibbles疫苗初次腹股溝淋巴結(jié)免疫，每只30 μg·(20 μl)-1，第5、7天分別皮下加強(qiáng)，每只30 μg·(200 μl)-1。DRibbles+DC免疫組：HBV+DRibbles腹股溝淋巴結(jié)初次免疫，每只30 μg·(20 μl)-1，第5、7天分別腹部皮下注射負(fù)載HBV+DRibbles的DC加強(qiáng)免疫，2×106只-1。于免疫后第8天處死小鼠，取脾臟與淋巴結(jié)來源的淋巴細(xì)胞，加入48孔板，終細(xì)胞濃度2×106ml-1；分別加入10 μg·ml-1HBsAg、HBcAg、HBc129-140(PPAYRPPNAPIL)、HBs190-197(VWLSVIWM)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2下培養(yǎng)72 h，ELISA法檢測上清中IFN-γ水平。

1.2.9 負(fù)載HBV+DRibbles的DC制備 復(fù)蘇DC，調(diào)整為2×106只-1，加HBV+DRibbles 30 μg·只-1，LPS 1 μg·ml-1，培養(yǎng)6 h；取出，加PBS洗滌，以1 200 r·min-1離心10 min，共3次；PBS重懸DC，置冰上備用。

1.2.10 HBV+DRibbles單獨(dú)或聯(lián)合DC治療HBV急性感染 分組與免疫同方法1.2.8；于末次免疫后第14天采血，分別采用ELISA法、熒光定量PCR法、酶法檢測小鼠血清HBeAg、HBV DNA、ALT及AST水平[7]；處死小鼠，取肝組織，免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá)，顯微鏡計數(shù)HBcAg+肝細(xì)胞比例，HE染色觀察肝組織病理變化。

1.2.11 HBV DNA檢測 按“乙肝病毒核酸定量試劑盒PCR熒光探針法”說明書操作。

1.2.12 HE染色及免疫組織化學(xué)染色檢測 100 ml·L-1甲醛固定肝組織，石蠟包埋；切片脫蠟。HE染色：至水，蘇木素染色，分化，伊紅復(fù)染，干燥封片。免疫組織化學(xué)染色：抗原修復(fù)；PBST(5 ml·L-1吐溫20 PBS)洗滌，加兔抗人HBcAg-IgG(1∶150)，4 ℃過夜；PBST洗滌，加HRP標(biāo)記羊抗兔多聚體，37 ℃ 30 min；PBST洗滌，加DAB顯色；流水沖洗，蘇木素復(fù)染；分化；干燥，脫水；透明；封片。

1.2.13 轉(zhuǎn)氨酶檢測 貝克曼庫爾特LX20全自動生化儀酶法檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應(yīng)細(xì)胞的體外增殖

HBV+DRibbles、HBsAg體外再刺激HBsAg免疫小鼠淋巴細(xì)胞，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IFN-γ顯示,與培養(yǎng)液對照組及HBsAg蛋白刺激組相比，HBV+DRibbles刺激組能夠產(chǎn)生更高水平IFN-γ，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。分選獲得HBsAg免疫小鼠的CD4+或CD8+T細(xì)胞，加入負(fù)載HBV+DRibbles或HBsAg的DC細(xì)胞體外再刺激結(jié)果顯示，與未負(fù)載抗原對照組和負(fù)載HBsAg的DC組相比，負(fù)載HBV+DRibbles的DC組均能夠再刺激CD4+或CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生更高水平IFN-γ，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1B、C)。提示：HBV+DRibbles是交叉遞呈HBV抗原的有效載體。

A.HBV+DRibbles、HBsAg體外刺激HBsAg特異性效應(yīng)細(xì)胞72h，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IFN-γ含量(n=3);B、C.HBV+DRibbles、HBsAg負(fù)載DC細(xì)胞體外刺激HBsAg特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞72h，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IFN-γ含量(n=3)

圖1 HBV+DRibbles刺激HBsAg特異性效應(yīng)細(xì)胞體外增殖

A.HBsAg-specific effector cells were re-stimulated with HBV+DRibbles or soluble HBsAg for 72 h,the levels of IFN-γ in supernatants were measured by ELISA(n=3); B，C.Immunomagnetic beads sorted CD4+or CD8+T cells were co-cultured with HBV+DRibbles or HBsAg preloaded DC for 72 h,the levels of IFN-γ in supernatants were determined by ELISA(n=3)

Fig 1 The proliferation of HBsAg-specific effector cells re-stimulated with HBV+DRibblesinvitro

2.2 HBV+DRibbles疫苗單獨(dú)或聯(lián)合DC免疫誘導(dǎo)HBV特異性細(xì)胞應(yīng)答

分別采用HBV+DRibbles及DRibbles+DC疫苗免疫小鼠，收獲小鼠脾細(xì)胞，加入HBsAg、HBs肽、HBcAg和HBc肽體外再刺激，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IFN-γ含量。與PBS對照組相比，HBV抗原及肽再刺激HBV+DRibbles疫苗免疫小鼠的淋巴細(xì)胞，均能夠產(chǎn)生較高水平IFN-γ，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與HBV+DRibbles疫苗組相比，DRibbles+DC免疫組IFN-γ水平有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。提示：HBV+DRibbles疫苗單獨(dú)或聯(lián)合DC免疫均能夠誘導(dǎo)多種HBV抗原及肽特異性的免疫應(yīng)答。

2.3 HBV+DRibbles疫苗單獨(dú)或聯(lián)合DC免疫對HBV急性感染的治療作用

以pAAV/HBV1.2質(zhì)粒[6]尾靜脈高壓注射C57BL/6小鼠誘導(dǎo)的HBV感染初期模擬急性HBV感染階段，對HBV急性感染模型小鼠實(shí)施HBV+DRibbles單獨(dú)或聯(lián)合DC治療性免疫。與PBS對照組相比，HBV+DRibbles單獨(dú)或聯(lián)合DC免疫均能有效降低小鼠血清HBeAg水平(圖3A)、HBV DNA水平(圖3B)、肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá)水平及HBcAg+肝細(xì)胞比例(圖3C、D)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時，與HBV+DRibbles疫苗組相比，DRibbles+DC免疫組小鼠血清HBeAg(圖3A)、HBV DNA水平(圖3B)、肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá)及HBcAg+肝細(xì)胞比例(圖3C、D)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示：HBV+DRibbles疫苗單獨(dú)或聯(lián)合DC細(xì)胞免疫對HBV急性感染具有一定的治療作用。

圖2 HBV感染急性期不同方案免疫誘導(dǎo)HBV特異性細(xì)胞應(yīng)答(n=3)

Fig 2 Cellular response induced in acute HBV infection(n=3)

為了觀察疫苗治療是否會造成小鼠肝組織損傷，我們檢測了小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平及肝組織病理變化。與未免疫PBS對照組相比，HBV+DRibbles單獨(dú)及聯(lián)合DC免疫組小鼠血清ALT、AST水平未見明顯變化(圖4A、B)，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，僅見輕度小灶性壞死伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖4C)。提示：HBV+DRibbles單獨(dú)或聯(lián)合DC細(xì)胞疫苗治療未造成明顯的免疫病理損傷。

A、B.ELISA法及熒光定量PCR法檢測血清HBeAg及HBV DNA水平; C.顯微鏡計數(shù)HBcAg+肝細(xì)胞數(shù)量; D.免疫組織化學(xué)法觀察小鼠肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá)(n=6 ×200)

圖3 HBV+DRibbles疫苗對HBV急性感染治療效果的檢測

A，B.The levels of serum HBeAg and HBV DNA was determined by ELISA and real-time PCR.C.The percentage of HBcAg+hepatocytes was counted under microscope.D.Intrahepatic HBcAg was visualized by immunohistochemical staining(n=6 ×200)

Fig 3 Therapeutic efficacy of HBV+DRibbles vaccine in acute HBV infection

3 討 論

HBV感染的控制和病毒的清除有賴于機(jī)體免疫系統(tǒng)，慢性HBV感染的機(jī)體產(chǎn)生HBV特異性免疫應(yīng)答能力受損。HBV主要感染肝細(xì)胞，而肝細(xì)胞缺乏共刺激分子，直接遞呈HBV抗原途徑不能有效誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化，專職抗原遞呈細(xì)胞的交叉遞呈被普遍認(rèn)為是誘導(dǎo)HBV特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的重要途徑[8-10]。本研究證實(shí),HBV+DRibbles作為HBV抗原的有效載體，不僅能夠誘導(dǎo)DC對HBV抗原的直接遞呈，而且能夠誘導(dǎo)DC對HBV抗原的交叉遞呈，從而誘導(dǎo)有效的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。

本研究中，HBV+DRibbles疫苗通過淋巴結(jié)注射途徑免疫小鼠。與其他免疫途徑相比，淋巴結(jié)組織富含DC等抗原遞呈細(xì)胞，抗原直接注射能夠靶向這些細(xì)胞，延長其接觸抗原的時間，增強(qiáng)對抗原的攝取，使得更多DC接觸T細(xì)胞，從而刺激大量T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平、特異性CTL應(yīng)答[11-14]。我們前期抗腫瘤研究顯示,將DRibbles疫苗直接注射腹股溝淋巴結(jié)，可以募集大量DC并促進(jìn)T細(xì)胞活化與增殖，進(jìn)一步促進(jìn)DC對抗原的交叉遞呈，引發(fā)強(qiáng)烈、特異性的CTL應(yīng)答。本研究顯示，在模擬HBV急性感染的模型小鼠中，采用HBV+DRibbles疫苗初次淋巴結(jié)免疫伴皮下加強(qiáng)的免疫策略，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生HBV多特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，有效抑制HBV復(fù)制、清除HBV感染的肝細(xì)胞。

為了進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫效果，我們在疫苗組分中增加DC。通過小鼠尾靜脈高壓注射法，聯(lián)合輸注FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)質(zhì)粒和GM-CSF質(zhì)粒，收獲小鼠脾臟，制備DC[15]。通過流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)，小鼠聯(lián)合輸注Flt3L質(zhì)粒和GM-CSF質(zhì)粒后，脾臟細(xì)胞中CD11c+細(xì)胞比例達(dá)10%～30%，且DC具有多種亞群。

研究顯示，與HBV+DRibbles疫苗單獨(dú)免疫組相比，DRibbles+DC免疫組誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答水平有增強(qiáng)趨勢，但細(xì)胞應(yīng)答水平與治療效果均無差異，分析可能與實(shí)驗(yàn)中所制備的DC有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，采用Flt3L擴(kuò)增人DC的同時也會導(dǎo)致CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞增殖，降低人外周血中CD8+T細(xì)胞與Treg細(xì)胞比例[16]。GM-CSF來源的DC能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞無能及轉(zhuǎn)換初始T細(xì)胞為FoxP3+Treg細(xì)胞[17]；且我們在收獲脾細(xì)胞時未能進(jìn)一步純化DC，其中CD11c+細(xì)胞只占10%～30%，含有非DC組分，而這些非DC組分亦可能發(fā)揮了免疫抑制作用；另外，疫苗的施用劑量、途徑等亦可能影響治療效果[18]。本研究為慢性HBV感染的治療提供了新思路。

A、B.全自動生化儀酶法檢測小鼠血清ALT、AST水平；C.HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)(n=6 ×400)

圖4 HBV+DRibbles疫苗治療的免疫病理損傷觀察

A，B.Serum ALT and AST levels were measured on automated clinical chemistry analyzer.C.The liver sections were stained with hematoxylin-Eosin(n=6 ×400)

Fig 4 Liver immunopathology mediated by HBV+DRibbles vaccination

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Study on therapeutic efficacy of autophagosome derived from HepG2.2.15 cells against acute HBV infection

WANG Lu,XUE Meng,YIN Peng-fei,FAN Fei,CAO Meng,WANG Li-xin

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Objective： To investigate the ability of HBV antigens inducing DC cross-presentation and to elicit HBV specific immune response by HepG2.2.15 cells(HBV+DRibbles)invitroand its effectiveness in acute HBV-infected mouse model.Methods: HBsAg-specific effector cells were re-stimulated with HBV+DRibbles or soluble HBsAg, then isolated CD4+or CD8+T cells were co-cultured with HBV+DRibbles or HBsAg preloaded DC.The levels of IFN-γ in supernatants were measured by ELISA.Lymphocytes from HBV+DRibbles alone or in combination with DC immunized acute HBV-infected mice or unvaccinated control mice were re-stimulated with HBV antigens and peptides, and the amounts of IFN-γ in supernatant were analyzed by ELISA.The levels of serum HBeAg, HBV DNA, ALT and AST were detected by ELISA, real-time PCR and enzyme method, respectively.The expression of HBcAg in hepatocytes was determined by immunohistochemical staining and the percentage of HBcAg+hepatocytes was counted under microscope.The liver sections were stained with hematoxylin-eosin.Results: The HBV+DRibbles stimulated HBsAg specific lymphocytes produced much higher IFN-γ than soluble HBsAg(P=0.004).Also, the CD4+or CD8+T cells re-stimulated by HBV+DRibbles preloaded dendritic cells generated significant higher IFN-γ(P<0.001).Levels of IFN-γ in supernatants of HBV antigens and peptides re-stimulated lymphocytes from the mice immunized with HBV+DRibbles alone or combined with DC were much higher than that of control group.While the differences were not significant between the mice vaccinated with HBV+DRibbles alone and in combination with DC.Compared with unvaccinated control group, both of the therapies could remarkably reduce the levels of HBeAg and HBV DNA and decrease HBcAg expression in hepatocytes and the percentage of HBcAg+hepatocytes, whereas the serum ALT and AST levels were not affected by vaccinations.The livers showed normal architecture and a mild inflammatory responses.No significant difference was observed between the mice treated with HBV+DRibbles alone and in combinationinvivo.Conclusion: HBV+DRibbles are efficient antigen carriers for effective cross-presentation.HBV+DRibbles can induce multiple HBV-specific T cell responses, effectively suppress HBV replication, clear the HBV-infected hepatocytes and do not cause severe liver damage.HBV+DRibbles in combination with DC do not further improve the therapeutic efficacy．

hepatitis B; hepatitis B rirus; autophagosome; therapeutic vaccine; mice

2016-02-25

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370895,31170857,30972783)

王璐(1983-)，女，安徽合肥人，主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士。E-mail:joy83627@126.com

王立新 E-mail:lxwang@seu.edu.cn

王璐，薛萌，殷鵬飛，等.HBV+自噬小體疫苗治療HBV急性感染的實(shí)驗(yàn)研究[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：647-653.

R392.11; R512.62

A

1671-6264(2016)05-0647-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．001