食品中A.hydrophila分析方法研究

羅紅梅

摘要：A.hydrophila原為水生細菌，廣泛存在于淡水，海水及各河海交會口，故水產食品常可分離出此菌。除了水產品外，各種生肉類和內臟、即食肉類和生菜沙拉等此菌的檢出率為5.15%和22.83%。此外，生牛奶、鮮乳、乳酪和冰淇淋也可分離出A.hydrophila。文章對食品中的A.hydrophila分析方法進行了研究。

關鍵詞：食品；A.hydrophila分析方法；水生細菌；水產食品；食品檢測 文獻標識碼：A

中圖分類號：TQ317 文章編號：1009-2374（2016）30-0067-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.30.032

1 Aeromonashydrophila基本特性

Aeromonashydrophila屬于弧菌科（Vibrionaceae）Aeromonad屬，為革蘭氏陰性的兼性厭氧桿菌，直徑0.3～1.0μg/mL，長1.0～3.5μg/mL，具單一極鞭毛，有運動性。此菌為異營性（heterotrophic），能產生oxidase及catalase，并可利用某些碳水化合物產生酸或同時產氣（CO2、H2），亦會水解esculin。

2 傳統分析方法

2.1 利用培養基分離

早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內菌屬或海洋弧菌屬的培養基，由于A.hydrophila具有lactose（+）及lactose（-）的菌株，而用以分離腸內病原菌的培養基中的碳水化合物成分，常會抑制Aeromonas菌屬的生長。因此，一般用分離腸內菌的培養基MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar等并不適用。近年來，許多學者分別針對食品或水等不同的來源而發展出適用的培養基，且培養基中皆添加ampicillin來抑制其他雜菌的生長，更有利于Aeromonas菌屬的回收。例如在臨床上，對于此菌的分離大多采用5%sheepbloodagar，另外添加1030g/mL的ampicillin，配合此菌產生β-溶血素的能力來區分，皆較以往分離腸內菌的培養基佳。且由于A.hydrophila氧化酵素反應常與培養基成分有關，而用sheepbloodagar并不會對此反應造成干擾。對于食品中此菌的分離，同樣可以ampicillin（10g/mL）作為抑制劑，starch則是用以區分的受質，當菌落形成后，加入Lugolsiodinesolution，菌落為amylase（+）者，即為A.hydrophila。此方法已被廣泛應用于食品中A.hydrophila的分離，然而SA無法區分A.hydrophila與A.caviae。

另外，Oxoid公司將XLD（xyloselysinedeoxycholate）修飾后發展出RyansAeromonasmediumbase，再添加5μg/mL ampicillin，專用以分離Aeromonas及Plesiomonas菌屬，前者為深綠色菌落，后者則為藍灰色菌落（OxoidproductcodesCM833）。以SA、SGAP（starchglutamateampicillinagar）及RAM（RyansAeromonasmedium）來比較食品中A.hydrophila的分離率，結果三種選擇性培養基皆有93%以上的分離率，并無顯著差異。

Tsai和Chen（1996）以三種選擇性培養基SA、Bloodampicillinagar（BA）及OxoidAeromonasagar（OA）分離水產品中A.hydrophila，結果以BA分離出此菌的比率最高，SA及OA所得的典型菌落，經生化測試后，許多菌落為A.sobria或A.caviae，顯示此兩種選擇性培養基對A.hydrophila、A.caviae以及A.veronii辨識度較差，可能是因為OA中的ampicillin濃度較低所致。

水中A.hydrophila的分離則大多采用，先將樣品增殖培養（enrichment）后，以膜過濾，再置于ADA上培養。而Holmes及Sartory（1993）以ADA、XAA、RAM及BIBA比較146個水樣中Aeromonasspp.的分離率，結果以ADA及RAM回收率較好。

2.2 利用生化特性鑒定

A.hydrophila的鑒定方法一般是參考BergeysManualofSystematicBacteriology進行各種生化測試，例如oxidase、catalase、starchhydrolysis、fermentationofglucose、mannitol、fructose、galactose、dextrin及esculin水解等。然而傳統生化測試有其困難點，A.hydrophila培養在不同培養基，對相同生化測試，不一定有相同的反應，且耗費很多時間配制培養基，需要進行繁復的測試，因此商業上發展了鑒定套組來加以確認。于鑒定套組方面，可以通過比較API20E、APIRE及APINFT等套組，顯示API20E鑒定的正確率達100%，APIRE及APINFT分別只達77%及87%的正確率。于實際應用時，API20E亦可準確鑒定出牡蠣、臨床及環境的A.hydrophila分離株，但是由于許多環境分離株未列入API資料檔，因此以API20E鑒定環境分離株時，應同時對一些重要生化反應，再輔以傳統生化測試方法以

確認。

而對于API20E、APINE及Microbact24NE做比較，可以發現API20E鑒定的正確率只達72.5%，而APINE及Microbact24NE的正確率則皆達97.5%。另外，也可以GNMicroplate（BIOLOG，Hayward，Calif）測試60株臨床分離株（A.hydrophila、A.sobria及A.caviae各20株）對于95種碳源的氧化能力，認為此套組能有效地鑒定出臨床的Aeromonas分離株。在傳統鑒定中，利用選擇性培養基分離出可疑菌落，以生化測試確認；而鑒定套組只能縮短生化測試的時間，仍需輔以傳統方法確認。

3 快速分析方法

由于A.hydrophila的傳統分析方法，除了選擇性培養基多種選擇外，各種生化套組鑒定時仍需輔以傳統生化測試，耗時費力，無法因應工業界快速得知結果的要求。人們極欲發展此菌的核酸探針及免疫分析的快速分析方法。

3.1 核酸探針

A.hydrophila共含三個DNAhybridizationgroup，即HG1、HG2、HG3，由環境中分離的以HG3為主，病患檢體中分離的菌株，則以HG1為主。利用16SrRNA為引子，以PCR分析鑒定環境中的菌數與雜交的相關性，檢測67件樣品，顯示在海水（22/67）、溪水（3/67）、臨床檢體（0/67）的檢出率不高，且與其他菌株有交叉反應。另外，探討由人的糞便分離Aeromonasspp.菌株的表現型與DNA的相關性，發現基因分類與表現型的鑒定有時檢測結果不一致，其建議當表現型及一些生化測試不具特異性時，需輔以基因的測試。為了發展核酸探針以快速分析A.hydrophila，必須先尋找A.hydrophila所特有的基因。從水域中的A.hydrophila找到其腸毒素基因，進一步發現A.hydrophila的腸毒素與霍亂毒素兩種基因的DNA核酸序列相似，因此不適合當特異性的探針。

利用A.hydrophila溶血基因建立了長度為48個寡核酸的探針，并另外由霍亂弧菌毒素基因建立了長度為34個核酸（C1）及19個寡核酸（C2）的探針，其首先以A.hydrophila溶血基因探針，利用菌落雜交法，找出呈陽性反應的A.hydrophila菌落，抽取其染色體DNA后，再用南方轉移，再分別以霍亂毒素基因片段C1、C2為核酸探針進行DNA雜交法，發現部分菌株與霍亂弧菌毒素探針（C1）有陽性反應，但對C2探針則為陰性反應，顯示霍亂弧菌毒素基因及水域菌株的溶血素基因的核酸序列相似。因此目前利用A.hydrophila溶血基因片段所建立的核酸探針法尚無法克服偽陽性反應的問題。利用randomlyamplifiedpolymorphicDNA（RAPD）技術分類7株A.hydrophila菌株，經PCR產生DNA，以SmaⅠ限制產生指紋圖譜，發現此7株菌在RAPD沒有一致性的片段，顯示其基因變化大。

3.2 免疫分析法

免疫分析法包含免疫沈淀法、免疫電泳法、免疫熒光法、放射性免疫分析法（RIA）和酵素免疫分析法（EIA），均已用于臨床及病原菌的抗原測定。放射性免疫分析法和酵素免疫分析法具有高敏感性。

4 結語

目前對A.hydrophila的分離與鑒定尚未標準化。早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內菌屬或海洋弧菌屬的培養基，然而如MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar中的碳水化合物會抑制部分A.hydrophila的生長，并不適用于分離。近年來，許多學者分別針對病人檢體、食品或水等不同來源的菌株而發展相關的培養基，且均利用ampicillin來抑制其他雜菌的生長。然而不論何種選擇性培養基，其上可疑菌落均必須經過生化鑒定，方能確定為A.hydrophila。

參考文獻

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