油茶產黃酮內生真菌的發酵工藝優化

張婷

摘要 在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法對油茶產黃酮內生真菌的發酵條件進行研究，結果表明，油茶產黃酮內生真菌Y-UH-2的最適發酵條件為：培養基起始pH值為7，接種量為5 %，培養溫度為28 ℃，轉速170 r/min，其黃酮產量為3.18 mg/100 mL，比未優化時高出42%。

關鍵詞 黃酮產量；油茶；植物內生菌；單因素優化；正交優化

中圖分類號 S794.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）20-0260-02

Optimization of Fermentation Conditions of Flavonoids-producing Strain of Camellia oleifera

ZHANG Ting

（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen Hubei 448000）

Abstract The fermentation conditions of flavonoids producing strain of Cemellia oleifera were studied using orthogonal test，based on the single factor experments.The results showed that the optimum factors were as follow：the optimal intial pH value was 7，inoculation amount was 5%，the culture temperature was 28 ℃，fermentation speed was 170 r/min.The flavonoids yield was 3.18 mg/100 mL，improved by 42%，compared with the original state of strain Y-UH-2.

Key words flavonoids yield；Camellia oleifera；endophyte；single factor experments；the orthogonal test

植物內生真菌是指在一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的真菌，普遍存在于植物中[1]。由于內生真菌長期存在于宿主植物中，與宿主植物共同進化，能產生與宿主植物類似的活性物質，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農藥、增產菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用[2]。油茶（Camellia oleifera），別名茶油樹、茶子樹、白花茶，常綠小喬木。油茶是我國獨有的一種食用油料木本植物。茶油色清味香，營養豐富，且耐貯藏，是優質的食用油。另外，也可作為潤滑油、防銹油用于工業。茶油中含有的不飽和脂肪酸高達90%，遠高于菜油、花生油和豆油，與橄欖油相比VE含量高1倍，并且含有山茶甙等特定生理活性物質，具有相當高的營養價值。茶殼還是一種很好的食用菌培養基[3]。研究發現，油茶葉中含有多種黃酮類化合物，對這些黃酮類的獲得方式主要依賴于提取[4]。本研究對前期獲得的油茶產黃酮內生真菌的誘變菌株Y-UH-2進行發酵工藝優化，希望能為今后的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株。以油茶產黃酮內生真菌菌株的誘變菌株Y-UH-2為試驗菌株。

1.1.2 培養基。采用PDA培養基[5]，培養基配制完畢后，高壓滅菌鍋121 ℃，20 min。

1.1.3 試劑。蘆丁標準樣品購自荊州昌華試劑公司，葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蔗糖、氯化鈉、硝酸銨、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、乙酸乙酯等均為分析純，購自武漢科普化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SHZ-3 循環水多用真空泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；JJ-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州金凈凈化設備科技有限公司；722s可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DHWY-200B 恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DH-600A 電熱恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；100S-11高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵單因素優化試驗。參照冷桂華等[6-8]的研究文獻選取培養溫度、培養基起始pH值、轉速和接種量這4種單因素水平，如表1所示。

1.3.2 正交試驗。結合單因素優化結果，選取4個單因素的各3個水平，如表2所示，用L9（34）進行正交試驗設計。

1.3.3 黃酮含量的測定。按照沈建福等[9]的方法，測定一系列濃度不同的蘆丁標準液的吸光值，繪制蘆丁標準曲線。再根據蘆丁標準曲線計算出黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養溫度對發酵結果的影響。培養溫度對發酵條件的影響如圖1所示，溫度會影響菌株的生長繁殖速度，從而影響其代謝物質的產量。當培養溫度過低，僅20 ℃時，菌株生長緩慢，發酵密度降低，增加溫度，菌株生長速度提高，但繼續增加溫度超過28 ℃時，溫度過高影響了菌株的代謝過程，阻礙菌株中黃酮物質的積累，因此產黃酮含量少。在其他條件同等條件下，最適培養溫度為28 ℃。

2.1.2 轉速對發酵結果的影響。轉速對菌株發酵產黃酮的影響如圖2所示。當轉速為100 r/min時，轉速過低，影響溶氧效果，導致菌株生長緩慢，適當提高轉速，菌絲生長狀況得到提升，轉速過高超過150 r/min時，導致菌體濃度下降，黃酮產量隨之下降。因此，選擇最適轉速為150 r/min。

2.1.3 接種量對發酵結果的影響。當接種量為3%時，接種量少，菌株生長緩慢，黃酮產量偏低；增加接種量至5%時，黃酮產量隨之增加，繼續增加接種量，黃酮產量并沒有繼續增加，反而下降了，可能是接種量過大，營養不夠，抑制了菌株的生長，使得黃酮產量也隨之降低。因此，應該接入合適的菌量，使其快速生長。如圖3所示，在其他條件不變的情況下，產黃酮內生真菌發酵最適接種量為5%。

2.1.4 培養基起始pH值對發酵結果的影響。在微生物生長過程中，pH值影響微生物的生長繁殖。適合pH值既有利于菌體的生長繁殖，又可以最大限度地獲得高的產量。因為發酵過程中pH值是不斷變化的，所以起始pH值顯得尤為重要。如圖4所示，當pH值為5～7時，菌株發酵產黃酮產量逐漸上升，可能此時利用菌株生長，菌株發酵代謝產黃酮能力較強，再增加pH值，影響菌株的代謝過程，導致黃酮產量下降，因此選擇最適起始pH值為7。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗結果上，進行正交試驗，以黃酮含量為指標得到的結果如表3所示。極差顯示RC>RB=RA>RD，由此可見，培養基起始pH值因素對發酵過程產生的黃酮含量有明顯影響。表3顯示發酵培養的最佳因素組合為A3B2C2D2。按照這個試驗組合進行3組平行試驗進行驗證，黃酮含量分別為3.20、3.19、3.16 mg/100 mL，平均含量為3.18 mg/100 mL。均高于正交試驗的任何一組，比未優化前誘變菌株Y-UH-2（2.24 mg/100 mL）高出42%（表4），這表明油茶產黃酮內生真菌的最佳發酵條件是轉速 170 r/min，接種量為5 %，培養基起始pH值為7，培養溫度為28 ℃。

3 結論

利用微生物發酵生產有價值的代謝產物時，培養條件如pH值、發酵溫度等可變因子較多，因此在微生物培養時對培養條件的優化顯得尤為重要。本試驗結果表明產黃酮油茶內生真菌的發酵培養最佳條件是培養基起始pH值為7，接種量為5%，培養溫度為28 ℃，轉速 170 r/min，比未優化前產量提高了42%，高于張海龍等[10]在銀杏中篩選出的產黃酮內生真菌的黃酮產量。在后續的研究中，還需進一步提高菌株產黃酮類物質的能力，為開啟黃酮類物質獲取的新途徑提供試驗依據。

4 參考文獻

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