Leica DMI6000 B活細胞工作站的配置及應用

李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學 第一附屬醫院，陜西 西安 710061)

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·儀器設備供應與管理·

Leica DMI6000 B活細胞工作站的配置及應用

李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學 第一附屬醫院，陜西 西安 710061)

通過介紹Leica DMI6000 B活細胞工作站(Live Cell Application, LCA)的配置和技術參數，樣品制備要求，圖像采集的參數設置原則等，并以實例講解LCA目前在生物醫學領域的應用。DMI6000 B配有細胞孵育系統和圖像采集系統，孵育系統對活細胞進行常氧或缺氧培養，圖像采集系統實時采集細胞圖像。圖像采集系統中的焦平面跟蹤系統，可防止在延時拍攝中圖像變虛；明場與熒光多通道采集，可幫助實現活細胞熒光示蹤；多位點采圖，可幫助實現多視野動態觀察；拼接掃描可采集樣本全景圖像；z軸掃描可對樣本進行立體觀察。LCA具有倒置熒光顯微鏡和細胞培養箱的雙重功能，可跟蹤觀察活細胞的動態變化；DMI6000 B還可在缺氧條件下完成上述功能。

活細胞工作站； Leica DMI6000 B； 延時拍攝； 配置及應用

0 引 言

LCA是對活細胞進行不同水平動態研究的一款新儀器，對活細胞在培養的同時進行圖像采集，彌補了傳統顯微鏡只能定時觀察的不足。LCA在細胞水平可以實現定性與定量分析、活細胞圖像處理、活細胞動態示蹤，如研究活細胞增殖、遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、內吞[4]等生物學現象，細胞遷移過程的動態評估[5]、細胞遷移速率及軌跡的研究[6]、精卵結合過程研究[7]、受精卵起始72 h發育觀察[8]。在分子水平可做到基因定位定量表達的動態分析，如蛋白質翻譯[9]、降解、運輸、蛋白質相互作用的動態研究、蛋白質合成與胞內信號轉導、細胞骨架(細胞3D結構重建及空間定位)、細胞骨架的代謝動力學測定、細胞周期各時相的動態觀察[10]、熒光共振能量轉移FRET、熒光示蹤[11]等。因此，熟悉該儀器的配置和使用對從培養的細胞獲取更多有價值的研究資料具有非常重要意義。

1 Leica DMI6000 B配置和技術參數

(1) DMI6000 B倒置研究型熒光顯微鏡。該顯微鏡包含五個物鏡鏡頭：5×，10×，20×，40×，63×(油鏡)。其中5×，10×，20×物鏡具有相差功能。

顯微鏡使用EL6000緊湊型光源，熒光光源為汞燈，包含A、I3、N2.1三個熒光濾塊。A為UV激發藍光，激發光波長范圍：340～380 nm，發射光波長425 nm；I3為藍光激發綠光，激發光：450～490 nm，發射光515 nm；N2.1為綠光激發紅光，激發光：515～560 nm，發射光590 nm。

顯微鏡配有shuttle開關，用于減少延時拍攝中光源對樣本的損傷。每次采圖，shuttle自動打開，光源照射樣本采圖；采集完畢，shuttle自動關閉。

(2) PECON O2-CO2-℃孵育系統。該系統可提供的細胞常規培養條件：5%CO2，37 ℃恒溫，飽和濕度；可達到的缺氧濃度范圍1%～10%。

系統核心構成包括五部分：孵育器S.，加熱插件P或M96，3700 CTI控制器，37-2型電子溫控器，氧氣控制器。另外還配有CO2氣瓶、氮氣氣瓶和加濕器等。

系統工作原理：孵育器和加熱插件構成培養細胞的密閉小室；氮氣或壓縮空氣通過氧氣控制器和加濕器后，與CO2氣體共同進入CTI控制器加熱并混合，再輸出進入小室，為細胞提供常氧或缺氧培養環境。電子溫控器調控加熱插件及混合氣體溫度，溫控范圍10～40 ℃；CTI控制器調控CO2濃度，調控范圍2%～7.5%；氧氣控制器通過調控氮氣進入的流速來調控缺氧濃度。

(3) 焦平面跟蹤系統AFC(Adaptive Focus Control)。AFC可根據實驗時間及細胞空間位置(尤為垂直方向)的改變自動調節焦平面，確保在整個延時拍攝中，持續獲得樣本最清晰圖像。

AFC還可幫助實現多點延時拍攝，其AFC+HighSpeed模式可自動、快速調節不同視野的焦平面，消除因數次位置移動帶來的圖像變虛。

(4) CCD相機。配置了Leica DFC365FX，一款擁有144萬像素的高端熒光全幀CCD相機。它在信號較弱時，仍能采集到清晰的熒光照片，并可扣除樣本雜背景。

相機擁有標準和NIR兩種采集模式。NIR為近紅外模式，可采集并增強波長大于700 nm的近紅外波段，彌補了常規顯微鏡不能敏銳檢測近紅外波段熒光的缺陷。

(5) AF6000寬場系統。該系統成像原理為“面成像”，即一個時間點獲得整個二維圖像，區別于激光共聚焦的點成像，點成像是對樣本焦平面實現點照明，點掃描[12]。

(6) 操作和分析軟件。LAS AF 2.5操作軟件。

2 活細胞工作站樣品制備要求

(1) 待觀察樣品。貼壁或懸浮細胞、部分活體組織(DFC365FX相機說明書提及的三日齡黑腹果蠅幼蟲)。

(2) 熒光染料的選擇。參考前述1.1，熒光濾塊的觀察范圍。

(3) 培養器材的選擇。延時拍攝可選擇器材：直徑為35 mm或60 mm細胞培養皿、激光共聚焦專用皿、POC-R2顯微鏡細胞組織培養系統(見圖1)、96孔板、三維培養Lab-Tek Chamber Slide(見圖2)等。

圖1 POC-R2系統

圖2 Lab-Tek chamber slide

普通拍攝可選擇器材：不同直徑細胞培養皿、培養瓶、孔板、載玻片(選用0.13～0.17 μm厚度的蓋玻片[13])等。

3 Leica DMI6000 B圖像采集基本參數設置

3.1 長時間定時拍攝(延時拍攝)

(1) 時間序列采圖。單擊激活t選項，設置采集兩張圖片的時間間隔、采集圖像總時間或總循環數等(如，每15 min拍攝一張，拍攝8 h)。將圖像調節清晰后，選擇Adaptive Focus Control模式，勾選AFC on、on demand mode、Hold current position，開啟圖像采集。

(2) 多位點采圖。激活“Mark & Find”選項。在該選項中點擊相應圖標，可存儲或刪除某位置，設置完畢，點擊Start，儀器會按照設定的位置逐一采圖；還可實現多位點延時采圖，此時需開啟AFC+HighSpeed 模式，如前1.3述。

(3) 多通道采圖。點擊“+”“-”設置通道(FCr)數量，通過色表(LUT selection)為通道設定偽彩；在光路設置(Light Path Settings)中，通過Contrast Method選擇觀察方式如，明場BF、微分干涉DIC、熒光FLUO。

3.2 熒光采圖

在激發光濾片(Excitation Filter)中選擇合適的濾光片，如，A、I3、N2.1，見前述1.1。

將激發光強度(Intensity)調至4或5，若熒光染料抗淬滅性差可調至3；曝光時間(Exposure)200 ms左右最佳，最長不超過1 s；攝像頭信號的電子增益(Gain)不宜過高，建議調至2。

3.3 拼接掃描

激活“Tile Scan”選項，點擊鼠標定義某區域的兩個對角位置，可拼接多個相鄰視野，獲得大視野圖像。樣本較厚且要進行熒光拼接掃描時，需同時啟動z軸掃描，設定采圖上、下限，以獲得最清晰圖像(見圖5)。

3.4 z軸序列采圖

激活z選項，z-position代表焦平面當前位置。調節好樣本焦平面后，點擊并挪動立方體兩側箭頭設置z軸掃描上限(Begin)和下限(End)，點擊Start，儀器會采集該樣本不同層面的圖像。

4 活細胞工作站主要功能及在生物醫學領域的應用

4.1 明場條件下的延時拍攝

明場條件下的延時拍攝通過時間序列掃描，對活細胞進行長時間培養及觀察，實現對活細胞的動態研究。實驗結果既可導出隨時間改變的序列組圖，也可導出Movie。具體應用如，單細胞示蹤、實時觀察細胞遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、增殖(見圖3)、內吞[4]、融合[14]等生物學過程。

圖3 明場延時拍攝卵巢癌細胞SKOV3的增殖過程(100×)

細胞在傳代后4 h貼壁，19 h左右展現出完整形態，21 h變球形準備分裂，22 h第一次分裂完成；51 h其中一個子代細胞變球形準備分裂，51.5 h分裂完成；59 h另一個子代細胞變球形準備分裂，60 h分裂完成。最終由一個細胞生成4個細胞。

4.2 多通道圖像采集與熒光示蹤

多通道圖像采集可同時進行明場與熒光延時拍攝，并進行后期不同通道圖像疊加，可實現熒光示蹤等功能。用于觀察記錄細胞內外某特定成分的動態變化過程。如，熒光示蹤細胞周期中核的動態變化過程(熒光標記細胞核)[10]、老鼠胚胎干細胞體外發育過程(胞質表達熒光融合蛋白)[15]、小鼠卵母細胞后期成熟與極體排放過程(熒光標記DNA)[11]、腫瘤細胞凋亡過程(GFP標記細胞核)[16]、成釉細胞內吞熒光標記蛋白的過程[17]、熒光標記的siRNA片段轉染細胞過程(見圖4)等。

每張圖像右上角表示拍攝時間(時：分：秒：毫秒)。組圖依次為轉染后0，1，2 h直至8 h的明場與熒光疊加圖像。隨時間延長，細胞內綠色熒光增多，說明通過轉染進入細胞的siRNA片段增多。

4.3 拼接掃描

拼接掃描可用于拍攝明場或熒光條件下的組織全景圖、細胞或組織大視野圖(見圖5)。

4.4 z軸掃描

用于觀測樣品空間結構和空間定位。

4.5 缺氧培養

4.1及4.2所述功能也可在缺氧條件下進行，大大拓寬了該儀器的應用范圍。

圖4 雙通道延時拍攝FAM標記的siRNA片段轉染SKOV3細胞過程(200×)

圖5 銀杏樹枝橫截面 熒光拼接掃描局部圖(200×)

5 活細胞工作站維護與管理

5.1 日常維護

(1) 嚴格遵守儀器操作流程，避免因操作不當造成儀器損壞。

(2) 整個操作過程不要有液體流入系統，保持系統干燥和清潔，以防真菌生長。

(3) 使用完畢，切斷電源，清潔物鏡目鏡。鏡頭表面用擦鏡紙蘸取少量無水酒精，從中心往外周螺旋式擦拭。擦拭時勿對鏡頭表面施加壓力。鏡頭表面浸油可先用擦鏡紙抹去，再蘸取酒精擦拭。

(4) 顯微鏡表面和任何塑料部件只可用清水擦拭，不可使用有機溶劑。光學部件表面灰塵可用吸耳球吹去。

(5) 房間最適溫度15～25 ℃，濕度60%；系統工作溫度15～40 ℃(顯微鏡切勿超過40 ℃)。

5.2 使用過程注意事項

(1) 載物臺初始化：打開顯微鏡前，務必先將密閉小室從通氣與出氣管上取下，放在合適位置。否則開啟顯微鏡，載物臺自動初始化會使小室發生劇烈震動，損害儀器；

(2) 啟動多位點拍攝前載物臺初始化：開啟軟件時再做一次初始化。

(3) CTI控制器預熱30 min后再輸入CO2。若做缺氧培養，先輸入CO2，再輸入氮氣。

(4) 加濕器內最多加入350 mL水。

(5) 使用63×油鏡時，需使用顯微鏡DRY/IMM按鈕完成切換。

(6) 圖像和數據資料必須用光盤刻錄，嚴禁使用U盤。

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摘要的分類

按摘要的不同功能來劃分，大致有如下3種類型：報道性摘要、指示性摘要、報道—指示性摘要。

本刊要求科技論文寫成報道性摘要，而對綜述性、資料性或評論性文章可寫成另兩種摘要形式，下面著重介紹報道性摘要。

報道性摘要是指明一次文獻的主要范圍及內容梗概的簡明摘要，相當于簡介。報道性摘要一般用來反映科技論文的目的，方法及主要結果與結論，在有限的字數內向讀者提供盡可能多的定性或定量的信息，充分反映該研究的創新之處。科技論文如果沒有創新內容，如果沒有經得起檢驗的與眾不同的方法或結論，是不會引起讀者的閱讀興趣的，所以本刊選用報道性摘要，以比其他類摘要字數稍多的篇幅，向讀者介紹論文的主要內容，以“摘錄要點”的形式報道出作者的主要研究成果和比較完善的定量及定性的信息。篇幅以300字左右為宜。

(本編輯部摘編)

Configuration and Application of Live Cell Application Leica DMI6000 B

LIJing,YOUYuan-yi,SHIQing-xi,LIXu

(The First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

This paper introduces the configuration and function of Leica DMI6000 B Live Cell Application. It aims to expand applications of LCA in the field of biomedical research. The configuration and technical parameters, sample preparation requirements, parameter setting principles of image acquisition etc are comprehensively introduced, examples of applications of LCA in biomedical research are given. DMI 6000 B is equipped with incubating system as well as image acquiring system, the latter acquires real-time cell images when the former incubates cells in normoxia or hypoxia. In order to capture successive clear images in time-lapse imaging, adaptive focus control of image acquiring system is needed. The bright and fluorescence field help to realize living cell fluorescence trace, and multi-position image acquisition helps to get real-time cell images of several fields meanwhile. Tile scan supplies overview image of a sample; z-menu scans samples in three-dimensional. Therefore, LCA can be used for observing the dynamic changes of the cultured living cells since it integrates the function of inverted fluorescence microscope with cell culture incubator, furthermore, DMI6000 B can accomplish functions mentioned above in hypoxia.

live cell application; Leica DMI6000 B; time-lapse imaging; configuration and application

2015-04-15

國家自然科學基金面上項目(81372151)

李 婧(1984-)，女，陜西西安人，碩士，助理研究員，主要從事科研儀器設備與實驗室管理。

Tel.: 029-85323528, 18291420181; E-mail: li-jing-smile@163.com

李 旭(1956-)，男，陜西西安人，博士，教授，博士生導師，主要從事腫瘤學方面的研究。

Tel.: 029-85323528; E-mail: lixu56@mail.xjtu.edu.cn

Q 334

A

1006-7167(2016)02-0273-04