外植體的選擇對果樹葉片離體培養的影響研究

外植體的選擇對果樹葉片離體培養的影響研究

本文從外植體的基因型、葉片的發育程度、葉位及葉片切割方式等多方面對果樹葉片組織培養的影響因素做了有關論述，旨在對果樹葉片組織培養的研究方法及影響因子做一個比較系統的概述。

果樹葉片；離體葉片；外植體

植物的葉片是進行光合作用的主要部位，其因體量大、獲取方便等原因常常被作為植物離體培養的外植體來源。葉片離體培養的成功在植物基因克隆研究領域具有重要意義。在果樹學領域，隨著生物技術的不斷發展，利用葉片進行離體再生技術，已經在變異篩選、引種、性狀保存、繁殖育種及轉基因工程等方面得到廣泛的應用。本文就外植體的選擇情況對果樹離體葉片培養再生技術方面的影響做了詳細綜述。

1 外植體基因型對果樹葉片離體培養的影響

植物離體培養的情況首先受其基因型的限制。外植體的基因型是決定其離體再生能力的根本因素，具體表現為種和種以及品種之間再生能力的差異。時保華、趙政陽、孫清榮、達克東等均對不同蘋果品種的葉片離體培養再生能力進行過比較試驗，結果表明：不同蘋果品種的不定芽誘導需不同的生長激素配比和組合，適合葉片分化的條件因品種而異。Nehra等在研究草莓葉片離體再生試驗中，發現在供試的10個品種中，相同條件下只有“Redcoat”品種獲得高頻率再生芽，其不定芽再生率高達94%，這說明草莓葉片直接再生芽能力受基因型影響。所以，在選擇外植體材料來源時，必須首先考慮供試材料的基因型背景。

2 葉片發育程度和再生代數對果樹葉片離體培養的影響

葉齡或者繼代培養時間也是影響葉片再生能力的一個重要因素。于冬梅等在草莓葉片離體培養試驗中發現：M14葉齡為21～28 d的葉盤再生芽頻率最高，高達90%。葉齡在30 d以上，不定芽再生率普遍降低，僅為36%。用蘋果試管苗葉片為試材一般是選取繼代培養20～40 d的新梢葉片。如“皇家嘎拉”繼代培養21 d的葉片再生效果最好。在馬哈利櫻桃試管苗葉片離體培養試驗中，短于20 d的嫩葉培養初期均出現水浸狀態并且很容易出現死亡；50 d葉齡的葉片，在接種初期又極易出現褐化現象，再生頻率明顯降低。在枇杷葉片愈傷組織誘導的報道中根據葉齡將葉片分為三個等級：成熟葉(展葉后30 d左右，墨綠色)、中度成熟葉(展葉后10 d左右，綠色)、嫩葉(新展開葉，嫩綠色)。結果表明：枇杷葉片離體再生能力與葉片成熟度密切相關，過嫩或者過老的葉片均不適合用于誘導愈傷組織，展葉10 d左右的中度成熟葉是最佳的誘導材料。

3 葉位對果樹葉片離體培養的影響

在葡萄葉片離體培養研究中發現：不定芽的再生受葉位影響非常明顯，再生率隨葉序位置的下降而降低，數據顯示：葉位最上的第1片葉不定芽再生率最高，為33%；第2片則為23%；第3片葉片則降低為15%，而中部葉片及以下均沒有不定芽產生。對蘋果的研究也發現：愈傷組織的脫分化和再分化能力均與葉位有關。無論是蘋果幼苗還是成苗，均是上位葉再分化率較高，高達80%，下位葉較低，為60%。

4 葉片不同部位對果樹葉片離體培養的影響

在蘋果“皇家嘎拉”的葉片培養試驗中發現：在同一葉片上，葉中部比頂部或葉基部的葉段更易于再生植株。在梨的研究中也發現，“八月紅”不定芽產生于葉中部的中脈傷口及葉莖部傷口上較多，葉尖部則產生很少。這說明：葉片再生能力受所取葉片不同部位的影響也很大?？赡苁且驗閺娜~尖到葉基部，葉脈組織發達程度逐漸增強，運輸營養物質和生長激素的能力也增強。

5 葉片切割方式對果樹葉片離體培養的影響

外植體受傷程度直接影響褐化，為避免褐化的發生，應盡量減小切割長度并縮短外植體接種前與空氣的接觸時間。在蘋果試管苗葉片進行切傷及不切傷處理試驗中發現：切傷與不切傷處理對不定芽的發生有很大影響，從再生力、不定芽數、再生率等方面看，切傷均比不切傷高。同時又做了劃傷、切塊、縱切和橫切處理做對比，發現任何切傷方法相比不切傷處理，不定芽的再生能力都有明顯的提高。另有研究報道，微金屬粒子的轟擊也可以提高再生效果。原因可能有以下兩點：一是粒子轟擊造成傷口，有利于對培養基中營養及激素的吸收，二是創傷誘導了細胞胚胎發生有關的基因表達。

6 葉片消毒方式對果樹葉片離體培養的影響

接種之前一定先要對外植體進行消毒。一般先用軟毛刷子輕輕刷去表面的塵土，再將外植體浸入稀釋的洗衣粉水中浸泡30m in，再然后用自來水流水沖洗。接種前先用75%的酒精表面消毒20～30 s，再用0.1%～0.2%升汞消毒10m in。Fouad等指出：外植體采用0.5%次氯酸鈉表面殺菌15～20min，比用10%Ca(ClO)2或0.2%HgCl2處理芽的成活率高。Hammerschlag等人對5種常用消毒方法做了比較試驗，結果顯示：污染最輕的組合是外植體先用0.5%的NaClO+0.01%吐溫浸泡15～20min，再用100mg/L鏈霉素浸泡15m in，無菌水沖洗3次。消毒時間過長會對材料產生傷害，影響成活率。酒精消毒雖然效果較好，但易對材料造成傷害，加速褐化的發生。

7 小結

在果樹組織培養研究方面，利用葉片做外植體的報道已經很多，研究也越來越深入，但是還有很多果樹沒有成功的離體培養技術，比如三倍體枇杷的葉片再生體系的建立至今尚未見成功報道。本文系統概述了外植體影響組織培養的六大關鍵因素，希望能對以后果樹組織培養的研究有一定的幫助。

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053000 衡水學院生命科學學院 崔文寧