香煙煙霧提取物對外周血內皮祖細胞衰老的影響及其機制研究

鄭浩　李占魯　孔旭鋼　沈嘯華　傅國勝

[摘要]目的觀察香煙煙霧提取物（CSE）對外周血內皮祖細胞（EPC）衰老的影響，探討其司能機制。方法 密度梯度離心法獲取人外周血單核細胞，培養4d后，收集貼壁細胞，分別加入2.5%，5%，10%和15%的CSE干預。采用SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老細胞；MIT比色法檢測EPC的增殖能力；端粒重復序列擴增法（TRAP）.ELIsA定量檢測EPC端粒末端轉移酶活性；逆轉錄PCR法檢測人端粒酶逆轉錄因子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA水平；Western蛋白印跡檢測EPC Akt Ser磷酸化水平。結果CSE能顯著增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞數量，15%CSE影響最為明顯，同時顯著抑制EPC增殖能力；CSE能顯著抑制端粒酶活性及hTERT mRNA表達；另外，CSE能抑制EPCAkt磷酸化。結論CSE誘導EPC衰老，伴隨EPC增殖能力的損害，提示細胞衰老也許是CSE影響EPC功能的機制之一；CSE誘導EPC衰老可能與抑制EPC端粒末端轉移酶活性、減少hTERT mRNA表達及抑制Akt磷酸化有關。

[關鍵詞]香煙煙霧提取物；內皮祖細胞；衰老；端粒末端轉移酶

中圖分類號：R446.6 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2016）05-0348-03

自1977年Asahara及其同事第一次提出內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）以來，越來越多的證據顯示EPC在缺血組織的血管新生中扮演的重要作用。香煙煙霧中含有超過4000多種有毒物質。香煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）幾乎包含了香煙中所有的成分，如尼古丁、焦油等。研究顯示，長期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數量及功能，后者與心血管危險因素的發生有密切關系，甚至發現吸煙者的EPC在培養早期就出現大量死亡。但是吸煙致EPC功能損傷的具體機制尚不明確。細胞的增殖能力受細胞分化及衰老所調控。最近的研究表明，EPC數量減少、功能減退與細胞衰老有關。細胞衰老的機制尚不十分清楚，目前認為端粒末端轉移酶活性與細胞衰老關系密切。本研究利用體外培養人外周血單核細胞源的EPC，觀察不同濃度的CSE對EPC增殖功能的影響，進一步探討CSE對EPC衰老的影響及其可能機制。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑：人纖維連接蛋白（human fi-bronectin，HFN）購自Chemicon公司；淋巴細胞分離液購自Cedarlane公司；EGM-2MV購自Clonetic公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自華美生物工程公司，進口分裝；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Senescenceβ-Galactesidase Staining Kit）購自Biovision公司；TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA試劑盒購自Roche公司；Trizol購自Invitrogen公司；抗phospho-Akt-Ser473單克隆抗體、抗Akt單克隆抗體購自Cell Signalling Technology公司。

1.2方法：

1.2.1 EPC分離、培養：取健康、非吸煙成人空腹外周血20ml，密度梯度離心法獲取單核細胞（MNCs）。將MNCs接種于HFN包被的培養板。EGM-2 MV培養基（含EBM-2，5%胎牛血清及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素）培養4d，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗掉非貼壁細胞，換培養液繼續培養至7d，PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞供實驗用。貼壁細胞隨機分為5組：（1）對照組：含5%胎牛血清的EGM-2MV培養基（含EBM-2及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素）；（2）香煙煙霧提取劑各濃度組（共4組）：加入2.5%，5%，10%及15%CSE干預。

1.2.2香煙煙霧提取物制備：參照Carp和Janoff方法并改良，將一支去過濾嘴香煙連于一個連續抽吸驅動裝置，每支煙吸5min，一共抽吸兩支香煙。吸入的煙霧經過真空容器的一個入口通入50ml的EBM培養液中制成懸液，懸液用NaOH調至pH 7.4，經0.22um微孔濾膜（購自Millipore公司）過濾做為CSE原液。配置好的CSE于30min之內用于實驗。CSE原液加入含EPC的培養液中稀釋成所需濃度。10%的CSE作用大致相當于每天吸入30支香煙。

1.2.3細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色：在EPC培養7d后，加入各濃度的CSE干預24h，再進行SA-β-半乳糖苷酶染色。按照試劑盒提示說明書操作，鏡下觀察，計數200個細胞，確定藍色細胞百分比。

1.2.4增殖能力檢測：在培養第7d消化細胞、計數，采用MTF方法檢測EPC增殖能力。

1.2.5 TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒末端轉移酶活性：在EPC培養7d后，加入各濃度的CSE干預24h，按照TRAP-PCR-ELISA法進行端粒末端轉移酶活性測定。

1.3統計學處理：所有數據采用SPSSl0.0版統計學軟件分析，計量資料以（x±s）表示，組間資料比較采用ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 CSE對EPC衰老相關β-半乳糖苷酶染色、抑制EPC增殖能力、EPC端粒末端轉移酶活性的影響：我們之前的研究顯示，剛分離獲得的單個核細胞是圓形的，體積較小，懸浮于培養液中。培養7d后形成了梭形的內皮樣細胞。用FITC-UEA.T和acLDL-Dil對細胞染色后，通過共聚焦顯微鏡鑒定，UEA.T和DiLDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPC。流式細胞儀檢測貼壁細胞表面標志，即VEGFR2，CD34和AC133的表達以進一步確定為分化中的EPC。結果顯示，加入CSE與EPC培養24h后，可以明顯增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞數量。其作用呈明顯的劑量相關性，與對照組相比，15% CSE作用最為顯著。CSE誘導EPC衰老，我們進一步觀察CSE是否能影響EPC增殖能力。MTF法檢測發現，CSE在誘導EPC凋亡的同時可以顯著抑制EPC的增殖功能。CSE加入EPC培養24h后抑制EPC端粒末端轉移酶活性，其作用呈明確的劑量相關性，見表1。

2.2 CSE對EPC human telomerase reverse transcriptase（hTERT）mRNA表達的影響：為了觀察CSE對EPChTERTmRNA表達的影響，將不同濃度的CSE加入EPC培養6h，半定量RT-PCR結果顯示，CSE能顯著抑制hTERT mRNA的表達，呈明顯的量效關系，在15%的濃度時最為明顯，見圖1。

2.3 CSE對EPC Akt活性的影響：最近研究表明Akt在調節細胞衰老和端粒酶活性中扮演重要角色，因此，我們觀察了CSE對EPC活性的影響。Western蛋白印跡結果顯示，加入不同濃度CSE分別培養15min后，磷酸化Akt的表達隨CSE濃度的增加而顯著減少，在15%時達到最大效應。

3討論

本研究發現，CSE可以誘導體外培養EPC的衰老，伴隨著其增殖能力的降低。大量的研究顯示，EPC衰老與EPC數量減少和功能損害有關。長期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數量及功能，本研究為該現象提供了一定的分子學機制。在細胞分子水平上，染色體末端端粒的損耗是衰老的重要機制，端粒丟失最終可造成細胞衰老直至凋亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉錄酶，能以自身RNA為模板合成端粒DNA并添加到染色體末端，延長真核細胞染色體端粒。因此端粒酶活性缺乏可造成端粒長度的縮短從而誘導細胞衰老。大量研究顯示，各種心血管危險因子可以降低大鼠或人外周血EPC端粒長度及端粒酶活性，同時能增加衰老相關β-半乳糖苷酶陽性細胞比例。我們之前研究亦發規基質細胞衍生因子1α延緩EPC的衰老可能與端粒酶活動增加及端粒長度延長有關。因此，我們推斷EPC衰老可能與端粒端粒酶有關。

hTERT mRNA的表達和端粒酶的活性具有很強的關聯性。我們近期的研究亦顯示，基質細胞衍生因子1α抑制EPC衰老及促進缺血組織再內皮化與其促進hTERT mRNA表達有關。本研究顯示，CSE能降低EPC端粒酶活性，同時亦能抑制EPC hTERTmRNA的表達，據此我們推測CSE誘導EPC衰老可能與其抑制EPC端粒酶活性及抑制hTERT mRNA的表達有關。細胞衰老機制除了端粒學說（即復制下衰老）之外，尚有非端粒學說，后者包括氧自由基學說及DNA損傷學說。香煙煙霧中包含了4000多種物質，其中就包括大量的自由基和氧化劑。吸煙導致NO合成減少、EPC功能損傷與氧化應激有關。因此，CSE誘導EPC衰老的相關機制尚需進一步研究。