不同方法提取費約果葉片香氣成分的比較研究

白俊英,黃仁華,陸云梅,余 游,王 丹

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

?

不同方法提取費約果葉片香氣成分的比較研究

白俊英,黃仁華*,陸云梅,余 游,王 丹

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

分別采用索氏抽提法、超聲波輔助溶劑萃取法和頂空固相微萃取法對費約果葉片中所含香氣成分進行提取,經GC-MS進行分析,結合譜庫檢索技術,采用峰面積歸一化法進行定性和定量分析。結果表明,索氏抽提法所得香氣物質中鑒定出揮發性成分20種,占總揮發性成分的70.357%,且以烷烴為主,超聲波輔助溶劑萃取法所得香氣物質中鑒定出揮發性成分17種,占總揮發性成分的65.222%,且以酯類為主,頂空固相微萃取法所得香氣物質中鑒定出揮發性成分最多,有42種,占總揮發性成分的76.899%,且以萜烯類為主。由此可見,在費約果葉片香氣成分分析中頂空固相微萃取法能得到最多的香氣組分,索氏抽提法次之,超聲波輔助溶劑萃取法得到的香氣物質最少。

索氏抽提,超聲波輔助溶劑萃取,頂空固相微萃取,香氣成分

目前,關于天然植物香氣成分提取方面的報道有很多,提取的方法也多種多樣,陳常頌等[1]利用同時蒸餾萃取法(SDE)提取茶葉香精油;謝吉林等[2]利用減壓蒸餾法(VDE)提取普洱茶香氣物質;劉煜宇等[3]利用超臨界二氧化碳萃取技術(SFE)提取煙草花香氣成分;王延平等[4]采用固相微萃取(SPME)提取大紅袍茶提取物的揮發性致香成分。頂空固相微萃取技術(HS-SPME)是上世紀九十年代發展起來的新的樣品預處理技術,特別適用于微量樣品的分析。頂空固相微萃取技術在固相微萃取技術的基礎上直接采用萃取頭頂空吸附進樣,具有操作簡便快捷、無試劑污染等重要特點[5]。香氣物質的檢測通過氣相色譜-質譜(GC-MS)分析技術,能得到較好的定性、定量結果[6]。

費約果是一種集食用、藥用、園藝觀賞于一體的新興果樹,原產于阿根廷北部,烏拉圭、巴拉圭山區一帶,目前在世界多個國家有種植且在新西蘭生產、發展最好[7-8]。費約果果實、花、葉皆散發出濃郁香味,且含多種多酚類有效成分,具有一定的食用藥用價值和廣闊的應用前景[9-12]。相應產品在國際國內市場上皆供不應求。費約果葉片四季常綠,耐修剪,成熟葉片呈濃綠色革質,厚實且有光澤,修剪后散發令人愉快的芬芳氣味,可作為食品、化妝品添加劑的重要來源。在美洲、新西蘭等地,費約果為常見庭院植物,枝葉修剪每年產生大量垃圾,葉片資源往往被浪費掉;而中國的費約果引種栽培已有十余年時間,在廣大科研工作者的努力下,未來必將走進千家萬戶。可以預見,對費約果的深入研究必將促進新興果樹費約果在國內外的發展。據此,本研究對費約果葉片香氣成分進行了提取,并比較了頂空固相微萃取法與傳統的索氏抽提法和溶劑萃取法在費約果香氣分析方面的異同,以求為費約果葉片香氣成分的開發利用及后期相關研究提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費約果 四川綿陽,品種為“庫利激”兩年生潔凈葉片,于2015年5月7日上午9時采摘于西南科技大學西山校區費約果種植園;乙醚、無水氯化鈣 分析純;丙酮 色譜純;水 超純水。

Varian 3900-Saturn 2100氣相色譜-質譜聯用儀、氣相色譜-質譜口進樣針 美國Agilent公司;固相微萃取萃取手柄和Carboxen?/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS,75 μm)萃取頭 美國Supelco公司;20 mL頂空瓶 四川生科力科技有限公司;HH型數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;SZF-06A型脂肪測定儀 上海華睿儀器有限公司;電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PH-030(A)型干燥/培養二用箱箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 索氏抽提法 取新鮮費約果葉片若干,冷凍干燥后用萬能粉碎機粉碎,準確稱取費約果葉片粉末4 g于濾紙筒中,包扎好后置于索氏抽提器的抽提筒內,組裝好索氏抽提裝置后,用100 mL乙醚索氏提取至回流溶劑無色。重復3組,合并提取液。回收乙醚至約150 mL。加入無水氯化鈣顆粒8 g,脫水過夜。過濾后收集濾液,冷藏密封保存,備用。GC-MS進樣分析時取5 mL樣液稀釋3倍,取1 μL進樣測定。

1.2.2 超聲波輔助溶劑萃取法 取新鮮費約果葉片若干,冷凍干燥后用萬能粉碎機粉碎,準確稱取費約果葉片粉末10 g于錐形瓶中,加入100 mL乙醚,密封,超聲30 min后,取上清液于另一錐形瓶中,殘渣中再加入100 mL乙醚,重復提取3次,合并三次浸提液(墨綠色帶暗紅狀)。將浸提液旋轉濃縮至約150 mL。加入無水氯化鈣顆粒8 g,脫水過夜。過濾后收集濾液,冷藏密封保存,備用。GC-MS進樣分析時取5 mL樣液稀釋3倍,取1 μL進樣測定。

1.2.3 頂空固相微萃取法 取新鮮費約果葉片若干,冷凍干燥后用萬能粉碎機粉碎,準確稱取費約果葉片粉末1.5 g置于20 mL頂空瓶中,用具有聚四氟乙烯墊密封蓋密封,將瓶放在60 ℃水浴鍋中水浴平衡30 min后,將老化(首次使用時,萃取頭需要在氣相色譜進樣口老化,溫度300 ℃,時間30 min;以后每次使用前需在250 ℃下處理30 min,以確保脫去其可能吸附的揮發性成分)后的75 μm CAR/PDMS萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分,距離樣品一定高度,于60 ℃加熱吸附40 min,吸附后的萃取頭取出,并迅速插入氣相色譜進樣口,于250 ℃解析6 min,用于GC-MS分析,同時啟動儀器采集數據。

1.3 GC-MS測定條件

1.3.1 色譜條件 實驗采用Varian 3900-Saturn 2100 GC-MS,色譜柱為HP-5MS,含5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),色譜進樣口溫度:250 ℃,進樣量1 μL,柱室溫度:40 ℃,保持1 min,采用程序升溫以5 ℃/min的升溫速率升至240 ℃,保持15 min,載氣:高純氦氣,流速1 mL/min,不分流進樣,柱流量1 μL/min。

1.3.2 質譜條件 質譜接口溫度:220 ℃,電離方式:EI,電子能量:70 eV,離子源溫度:190 ℃;四級桿溫度:210 ℃,調諧方式:標準調諧,質量掃描方式:SCAN,溶劑延長:3 min,掃描模式:全掃描參數,質量掃描范圍:40～300 amu。

1.3.3 GC-MS測定方法 方法參考呂世懂等[13]并結合儀器操作規程和具體實際。先用丙酮洗滌GC-MS聯用儀進樣針6次以上,然后用待測樣液潤洗6次以上,排除其它物質干擾。待GC柱室溫度升至設定溫度后,開始進樣。用進樣針吸取1 μL樣液,迅速注入進樣口中,縮出進樣針。開始測試。樣品經GC-MS分析,各分離組分利用譜圖庫工作站數據處理系統采用峰面積歸一化法進行相對定量分析,求得各揮發性成分相對含量及離子峰出峰個數。

2 結果與分析

2.1 費約果葉片香氣成分GC-MS分析結果

圖1為不同方法提取費約果葉片揮發性成分所得化合物的GC-MS總離子流色譜圖。由圖可知,不同方法所得離子流色譜圖中,各色譜峰保留時間和峰強度有所差異。索氏抽提法能夠得到20種化合物,超聲波輔助溶劑萃取法能夠得到17種化合物,頂空固相微萃取法能夠得到42種化合物。

圖1 不同方法提取費約果葉片香氣成分總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components in feijoa leaves by different methods注：a-索氏抽提法,b-超聲波輔助溶劑萃取法,c-頂空固相微萃取法。

各成分的色譜峰經質譜掃描后得到相應的質譜圖,經計算機譜庫檢索分析,并結合相關文獻,鑒定出香氣成分,以峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。結果如表1所示。

2.2 不同提取方法提取費約果葉片所得香氣成分分析

索氏抽提法提取的香精油經GC-MS分析后,檢測到36個峰,在檢測時間內共鑒定出20個香氣組分。含量最高的是烴類,其次是醇類,隨后是酯類、萜烯類、其它類和醛酮類,分別占香氣總量的34.669%、18.989%、7.429%、6.957%、1.765%、0.548%。由此可見,索氏抽提法為含烷烴成分和醇類成分較多的樣品的分析提供了參考。其中,2,3-丁二醇可用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥及藥物手性載體等,在我國往往被添加到白酒中,以改善風味。

表1 三種方法提取費約果葉片揮發性成分分析

Table 1 GC-MS analysis results of aroma components in feijoa leaves by different extraction methods

序號化合物名稱分子式相對分子量相對含量(%)索氏抽提超聲波輔助溶劑萃取頂空固相微萃取醇類12，3-丁二醇C4H10O2907974--2(2R，3R)-(-)-2，3-丁二醇C4H10O290-0481-3(R)-(-)-2-戊醇C5H12O88-0155-43-甲基-2-丁醇C5H12O8805630573-52-異丙氧基乙醇C5H12O210410106--61-己炔-3-醇C6H10O98--01387反-2-甲基環戊醇C6H12O100--07958葉醇C6H12O100--41909(E)-2-己烯-1-醇C6H12O100--0157

續表

續表

注:表中“-”表示未檢測到。超聲波輔助溶劑萃取法提取的香精油經GC-MS分析后,檢測到26個峰,在檢測時間內共鑒定出17個香氣組分。其中,含量最高的是酯類,其次是萜烯類,隨后是烴類、其它類、醛酮類和醇類,分別占香氣總量的32.591%,20.652%,6.742%、1.855%、1.742%、1.640%。由此可見,超聲波輔助溶劑萃取法為含酯類成分和萜烯類成分較多的樣品的分析提供了參考。萃取出的組分中己酸丁酯呈清香、蠟香,有菠蘿和葡萄酒似香氣。

頂空固相微萃取法提取的香精油經GC-MS分析后,檢測到63個峰,在檢測時間內共鑒定出42個香氣組分。其中,含量最高的是萜烯類,有20種,其次是醇類,有10種,隨后是醛酮類、酯類、烴類、其它類和醚類,分別占香氣總量的45.627%,14.860%,10.752%、3.481%、1.656%、0.420%、0.103%。由此可見,頂空固相微萃取法為含萜烯類成分和醇類成分較多的樣品的分析提供了參考。提取出的組分中1-石竹烯是國標允許使用的食品香料,具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香和溫和的丁香香氣;α-蓽澄茄油萜具有花似的、檸檬的香氣;水芹烯具有令人愉快的、新鮮的、柑橘的、胡椒的氣味。

2.3 不同方法提取費約果葉片香氣成分的比較

由表1可知,三種方法共鑒定出費約果葉片中66種香氣成分。其中,2,3-丁二醇、2-異丙氧基乙醇、3-羥基-2-丁酮、2-乙基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環戊烷、2-甲氧基甲基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環戊烷、1,3,5-環庚三烯、(S)-(-)-乳酸異丙酯、乙酸-3-辛醇酯、萘只在索氏抽提法所得的香氣組分中出現；(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、(R)-(-)-2-戊醇、5-甲基-4-正辛醇、L-(-)-甘油醛、γ-古蕓烯、己酸丁酯、十五烷酸-14-甲酯只在超聲波輔助溶劑萃取法中出現,且己酸丁酯含量最高；頂空固相微萃取法所得香氣組分中鑒別出的物質最多,且有36種組分只在頂空固相微萃取法中出現,其中,多為萜烯類。

索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法所得香氣組分中共有物質較多,包括:3-甲基-2-丁醇、2-十六烷醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環戊烷、1,1-二乙氧基乙烷、[2.4]七螺-4,6-二烯烴、香橙烯、乙基苯、2,6-二叔丁酰基-對苯二酚(氫醌),8種,其中2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環戊烷和[2.4]七螺-4,6-二烯烴在兩種方法中含量均較高。索氏抽提法和頂空固相微萃取法中共有物為γ-欖香烯、大根香葉烯D、蓽澄茄油萜。超聲波輔助溶劑萃取法和頂空固相微萃取法中共有物質為l-去氫白菖烯、1-石竹烯。

3 討論

索氏抽提法可以避免溶劑的揮發損失且溶劑可回收,但在一定溫度下長時間進行反應,可能造成有效成分的破壞,因而只能反映費約果葉片部分香氣特性;超聲波輔助溶劑萃取法萃取時間短,溫度低,萃取徹底,但超聲波產生的空化作用可能造成某些香氣成分產生化學變化[14];頂空固相微萃取法直接在頂空部分萃取樣品,簡便快捷,目標物損失少,所以能得到相對最多的香氣組分,但頂空固相微萃取加熱溫度低,萃取物多為揮發性成分,可能遺漏高沸點物質和半揮發性物質。索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法的提取原理都是溶劑萃取,溶劑相同,所以得到較多共同組分。頂空固相微萃取法的萃取原理是一定溫度下揮發性成分在萃取纖維上的富集與解析,與溶劑萃取差異較大,所得香氣組分差異也大。在鑒定出的物質中,沒有一種香氣物質在三種方法中同時出現,可能是因為三種方法的共有物質未能被鑒定,也可能是因為頂空固相微萃取法針對的是低沸點物質和揮發性強的物質,而索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法得到的物質沸點較高且在乙醚中溶解性強。具體原因有待進一步研究。

三種方法提取費約果葉片所得香氣成分主要為醇類、萜烯類、醛酮類、酯類、烴類、醚類和其它,各種物質特有的香味相長相消、相互配合,最終構成了費約果葉片復雜而獨特的香氣。費約果葉片悅人的香氣不僅與葉片中香氣組分的含量有關,還與各組分的氣味閾值相關聯[15]。各類物質香氣組分的閾值及其對費約果葉片香氣的貢獻還有待進一步研究。

4 結論

索氏抽提法提取的物質經GC-MS分析后,檢測到36個峰,在檢測時間內共鑒定出20種香氣成分。超聲波輔助溶劑萃取法提取的物質經GC-MS分析后,檢測到26個峰,鑒定出17種香氣成分。頂空固相微萃取法提取的物質經GC-MS分析后,檢測到63個峰,鑒定出42個香氣組分。就得到的香氣成分種類而言,頂空固相微萃取法效果最好,索氏抽提法次之,超聲波輔助溶劑萃取法得到最少的香氣組分。三種方法鑒別出的總香氣組分有66種,每種提取方法所得香氣組分種類及含量各有不同,說明三種提取方法各有特色,能很好實現互補。在實際分析中,同時采用幾種不同提取方法所得物質更能全方位反映樣品組成及性質。在不同要求的研究和應用中,可根據不同方法提取費約果葉片香氣成分中不同組分的呈香特點及含量將其應用到需求中,如稀有香味物質制成高檔香料或據其特點進行人工合成,量大且常見的香氣物質可作為普通香味添加劑天然來源。

[1]陳常頌,張應根,鐘秋生,等. 同時蒸餾萃取法分析4種臺式烏龍茶香氣成分[J]. 食品與發酵工業,2011,02:165-171.

[2]謝吉林,肖海軍,鮑治帆,等. HS-SPME和VDE兩種方法對普洱茶香氣成分分析的比較研究[J]. 云南農業大學學報,2014,06:873-879.

[3]劉煜宇,李仙,念小魁,等. 響應面法優化煙草花超臨界二氧化碳萃取工藝及香氣分析[J]. 煙草科技,2013,06:45-49.

[4]王延平,梁儷恩. SPME-GC/MS法測定大紅袍茶及茶葉蛋鹵水味包中的揮發性致香成分[J]. 食品工業科技,2014,10:90-94.

[5]肖丹. 頂空固相微萃取技術的應用與展望[J]. 中國衛生工程學,2015,01:88-92.

[6]孔程仕,徐興英. 氣質聯用技術(GC-MS)在葡萄酒香氣成分分析中研究進展[J]. 飲料工業,2012,15(3):43-46.

[7]Nodari R O,Guerra M P,Meler K,et al. Genetic variability of Feijoa sellowiana germpl asm[J]. Acta Hort,1997,452:41-46.

[8]王丹,袁小紅,熊雙麗,等. 費約果營養、生物活性成分及應用研究進展[J]. 食品與生物技術學報,2015,04:337-348.

[9]NAKASHIMA H. Biological activity of Feijoa peel extract[J]. Kagoshima University Research Center for the Pacific Islands,Occasional Papers,2001,34:169-175.

[10]ROSSI A,RRGANOI D,PERGOLA C,et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression by an acetonic extract from Feijoa sellowiana Berg. fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13):5053-5061.

[11]BEYHAN ?,ELMASTAS M,GEDIKLI F. Total phenolic compounds and antioxidant capacity of leaf,dry fruit and fresh fruit of feijoa(Acca sellowiana,Myrtaceae)[J]. Journal of Medicinal Plants Research,2010,4:1065-1072.

[12]Thorp G,Bieleski R. Feijoas:Origins,Cultivation and Uses[M]. Hort Research,Ed. David Bateman,2002:11-12.

[13]呂世懂,姜東華,楊凡,等. 頂空固相微萃取/GC-MS分析普洱熟茶與安化黑茶香氣成分[J]. 熱帶作物學報,2013,34(8):1583-1591.

[14]王涓,潘忠禮,馬海樂,等. 超聲波的空化作用及其對多酚穩定性的影響[J]. 食品工業科技,2014,35(19):388-391.

[15]羅玉龍,靳志敏,劉夏煒,等. 肉制品中香味物質形成原因研究進展[J]. 食品與發酵工業,2015,41(2):254-258.

Comparison of aromatic components infeijoasellowianawith different extraction methods

BAI Jun-ying,HUANG Ren-hua*,LU Yun-mei,YU You,WANG Dan

(Southwest University of Science and Technology,College of Life Science and Engineering,Mianyang 621010,China)

ThearomaticcomponentsinfruitofFeijoa sellowianawereextractedbysoxhletextraction,ultrasonicassistedsolventextraction,andheadspacesolidphasemicro-extraction,analyzedbygaschromatography-massspectrometry,combinedwiththespectrallibraryretrievaltechnology,anddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theresultsshowedthattherewere20compoundsidentifiedbysoxhletextractionandthepercentoftotalpeakareawas70.357%andthemajorcompoundwasalkane,therewere17compoundsidentifiedbyultrasonicassistedsolventextractionandthepercentoftotalpeakareawas65.222%andthemajorcompoundswasester,andtherewere42compoundsbyheadspacesolidphasemicro-extraction,76.899%oftotalpeakareaandthemajorcompoundswasterpenoid.Thisshowedthatthemostkindofaromacompositionscanbeobtainedbyheadspacesolidphasemicro-extraction,followedbysoxhletextraction,andtheleastaromacompositionscanbeobtainedbyultrasonicassistedsolventextraction.

soxhletextraction;ultrasonicassistedsolventextraction;headspacesolidphasemicro-extraction;aromaticcomponents

2016-03-14

白俊英(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物有效成分，E-mail：337327450@qq.com。

*通訊作者:黃仁華(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：植物有效成分功能研究及開發利用， E-mail：huangrenhua@swust.edu.cn。

國家自然科學基金(31000259);四川省科技廳“十一五”科技項目(14zs2105)；校實驗室開放基金(15xnkf03)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)19-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.050