響應面法優化丁酸梭菌發酵培養工藝

邢宏觀,林建國,鐘雪兆,王常高,杜 馨,蔡 俊

(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室和工業發酵湖北省協同創新中心,湖北武漢 430068)

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響應面法優化丁酸梭菌發酵培養工藝

邢宏觀,林建國,鐘雪兆,王常高,杜 馨,蔡 俊*

(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室和工業發酵湖北省協同創新中心,湖北武漢 430068)

采用響應面法對丁酸梭菌生物量的發酵工藝進行優化。在單因素實驗的基礎上利用Plackett-Burman實驗設計篩選出影響菌體數的顯著性因素。在此基礎上,運用最陡爬坡實驗找出CCD實驗的中心點,并確定非顯著因素最低添加量來降低生產成本。最后通過響應面法分析獲得最佳發酵培養基組成成份。結果表明:酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4為影響菌體量的3個顯著性因素;可溶性淀粉2%、酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.37%、NaCl 0.2%、MgSO40.024%為最佳培養基組合;優化后的菌體數可達1.01×109個/mL,與優化前(2.3×108個/mL)相比,提高至4.39倍。

丁酸梭菌,生物量,響應面法,發酵工藝

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricumm)即丁酸梭狀芽孢桿菌,又名酪酸菌、宮入菌[1]。根據2001年聯合國糧農組織和世界衛生組織的專家們對益生菌的定義,C.butyricum符合益生菌標準,其最早于1944年在日本投入臨床應用,至今已經開發出多種相關的微生態制劑[2]。在臨床應用上,丁酸梭菌主要治療各種原因(腸道感染、外科手術等)所致的腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、非潰瘍性消化不良等疾病[3-6]。除了能調節機體腸道菌落平衡,提高免疫力外,也有報道稱丁酸梭菌對肝臟損傷有治療和預防的效果[9]。最新研究表明丁酸梭菌對治療癌癥也有一定功效[10-11]。

目前制約微生態制劑大規模生產的主要因素是在生物菌劑的制備過程中存在菌體生物量偏低的問題。響應面法(Response Surface Method),也稱響應曲面法,是通過對響應曲面及等高線的分析尋求最優工藝參數,采用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間函數關系的一種優化統計方法,其優點是在實驗條件優化過程中可以連續地對實驗因素的各個水平進行分析,克服了正交實驗[12-13]只能對一個個孤立的實驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷,所以它被廣泛應用于微生物發酵條件的優化和模型建立中[14-15]。徐瑩等[16]利用響應面法優化丁酸梭菌清液發酵工藝,使生物量由6.96×107cfu/mL提升到3×108cfu/mL;孔青等[17]利用CCD復合實驗優化丁酸梭菌淀粉培養基,最終生物量達到2.55×108個/mL;李雯靜等[18]通過PB實驗設計和響應面法優化丁酸梭菌發酵培養基,其芽孢數最終為1.478×108cfu/mL,是優化前的2.7倍。

本實驗采用單因素實驗設計方法,對影響丁酸梭菌生物量發酵液的相關組分進行初步優化,最后通過響應面法設計進一步優化其發酵配方,確定了最優培養條件,以期為丁酸梭菌大規模工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricumm),本實驗室自行篩選獲得。種子培養基:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,蛋白胨10 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,酵母浸粉3.0 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,硫代乙醇酸鈉0.30 g/L,半胱氨酸鹽酸鹽0.30 g/L,pH7.0;初始發酵培養基:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,蛋白胨10 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,酵母浸粉3.0 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,pH7.0;以上試劑均為分析純。

表2 中心復合設計實驗因素與水平

Table 2 The factors and levels of variables of CCD

因素編碼值與水平-1682-1011682A：酵母浸粉(g/L)466505560634B：FeSO4(g/L)14641618202136C：K2HPO4(g/L)28963134373904

PHS-25 pH計 上海雷磁;DNP-9052電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;血球計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化 取-20 ℃甘油管保藏的菌種200 μL接種于裝有9 mL種子培養基的厭氧管中,37 ℃條件下靜態厭氧活化24 h。

1.2.2 發酵培養 采用液體深層靜置培養:250 mL三角瓶裝液量100 mL,于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養。

1.2.3 菌體濃度測定 血球計數板法[19]。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 最佳除氧劑的篩選實驗 酸梭菌屬于嚴格厭氧菌,對培養液中溶解氧的濃度有嚴格要求,添加合適除氧劑可以降低培養液中的溶解氧濃度,利于菌體的生長。故選擇了Fe粉、FeSO4、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫代乙醇酸鈉和亞硫酸鈉作為除氧劑,初始添加量均為0.1%(注:文中所出現的添加量“%”均為“v/w”)。

1.2.4.2 碳源的優選實驗 共選擇了葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、蔗糖等7種碳源,初始添加量均為1%。

1.2.4.3 氮源的優選實驗 共選擇了蛋白胨、酵母浸膏、酵母浸粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉、大豆粉8種氮源,起始添加量均為1%。

1.2.4.4 金屬離子優選實驗 選擇了Mg2+、Zn2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+5種金屬離子,起始濃度均為5 mmol/L。

1.2.4.5 CaCO3添加量優選實驗 丁酸梭菌在代謝過程中會產生大量有機酸抑制菌體生長,添加一定量CaCO3有助于解除酸抑制。

1.2.5 Plackett-Burman設計 PB設計是一種2水平的實驗設計方法,是以最少量實驗次數挑選出對丁酸梭菌有顯著性影響的因素的實驗方法[20-21],對于N次實驗至多可研究(N-1)個因素。本實驗選取單因素優化實驗中對菌體生物量影響較大的培養基的5個組分以及初始培養基中的2種無機鹽共7個因素來進行PB實驗,每個因素取高(“+”)、低(“-”)2個水平,以菌體生物量為響應值Y,共進行12次實驗選取可信度大于95%以上的因素作為影響菌體生物量的主要因素。Plackett-Burman實驗設計的各因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平

Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman design

實驗因素水平(g/L)-1+1A可溶性淀粉10003000B酵母浸粉20006000CFeSO46001800DNaCl200400EK2HPO415035FMgSO4012036GCaCO3050150

1.2.6 最陡爬坡實驗 依據PB實驗所得到的顯著性因素,根據其正負效應設定各因素的步長及變化方向進行實驗,從而逼近最大響應區域,找到最大拐點值,確定下一步中心復合實驗的中心點。

1.2.7 最低添加量實驗 在Plackett-Burman實驗設計得出的不顯著因素基礎上,以培養基最節省為目的研究不顯著因素的最低添加量。根據各因素效應合理設計變化步長,通過單因素實驗確定培養基成分最優最小的用量。

1.2.8 中心組合(CCD)實驗設計 CCD實驗可利用有限的實驗次數,評價各個因素的影響,并分析各個因素之間的相互作用,分析過程中對實驗結果采用二階經驗模型對數據進行擬合。根據PB設計及最陡爬坡實驗的結果,通過軟件(Design-Experment 8.0.6)設計3因素5水平的實驗來確定丁酸梭菌的最適培養基成份,見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 最佳除氧劑的篩選實驗分析 從圖1可以看出FeSO4的除氧效果最佳,菌體數可達2.69×108個/mL,故選擇FeSO4作為除氧劑;從圖2可以看出當FeSO4添加量為1.2%時效果最佳,菌體數達到4.55×108個/mL,較之空白對照有顯著提高。

圖1 除氧劑對丁酸梭菌的影響Fig.1 The effect of deoxidant on the growth of C. butyricumm

圖2 FeSO4添加量對丁酸梭菌的影響Fig.2 The effect of addition amount of FeSO4 on the growth of C. butyricumm

2.1.2 碳源的優選實驗分析 從圖3中可以看出,可溶性淀粉效果最佳,菌體量可達5.73×108個/mL,故選擇可溶性淀粉作為最佳碳源;從圖4可以看出當添加量為2%時,菌體數達到最大為6.26×108個/mL,繼續增加其添加量菌體濃度開始下降,故選擇2%作為最適氮源添加量。

圖3 不同碳源對丁酸梭菌的影響Fig.3 The effect of carbon source on the growth of C. Butyricumm

圖4 可溶性淀粉添加量對丁酸梭菌的影響Fig.4 The effect of addition amount of soluble starch on the growth of C. butyricumm

2.1.3 氮源的優選實驗分析 從圖5可看出酵母浸粉效果明顯優于其它,菌體數可達4.10×108個/mL,玉米粉和大豆粉效果最差,故選酵母浸粉為最佳氮源;從圖6可以看出菌體數隨著酵母浸粉添加量的增加而升高,當添加量為4%時達到最高,為6.86×108個/mL,故選擇4%作為最適氮源添加量。

圖6 酵母浸粉添加量對丁酸梭菌的影響Fig.6 The effect of addition amount of Yeast extract powder on the growth of C. butyricumm

圖7 不同金屬離子對丁酸梭菌的影響Fig.7 The effect of ions on the growth of C. butyricumm

2.1.4 金屬離子優選實驗分析 從圖7可看出Mg2+對丁酸梭菌生長有促進作用,Zn2+、Ca2+、Mn2+則對其有抑制作用,Cu2+完全抑制其生長,故選Mg2+作為最佳金屬離子;其添加量由圖8可以看出為2 mmol/L時最佳,菌體數可達8.01×108個/mL。

表4 Plackett-Burman實驗設計的回歸分析

Table 4 Regression analysis for the Plackett-Burman design

項效應系數系數標準差Tp常量674580196034410000?可溶性淀粉-02483-0124201960-0630561酵母浸粉1365006825019603480025?FeSO41831709158019604670010?NaCl0368301842019600940401K2HPO41195005975019603050038?MgSO40475002375019601210292CaCO30135000675019600340748

注:模型在5%水平時差異顯著,“*”代表顯著因素;表4與表8同。

表5 Plackett-Burman實驗設計方差分析表

Table 5 Analysis of variable(ANOVA)for Plackett-Burman design

來源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFp主效應72126221262303756590044?殘差誤差41844184404611合計1123107R2=9202%R2Adj=7805%

圖8 Mg2+濃度對丁酸梭菌的影響Fig.8 The effect of concentration of Mg2+ on the growth of C. Butyricumm

2.1.5 CaCO3添加量優選實驗分析 從圖9中可以看出,CaCO3添加量為0.1%時效果最佳,菌體數達到8.45×108個/mL。

圖9 CaCO3添加量對丁酸梭菌的影響Fig.9 The effect of addition amount of CaCO3 on the growth of C. Butyricumm

2.2 PB實驗結果與分析

PB實驗設計結果見表3。對表3中的實驗結果進行方差分析和回歸分析,分析結果見表4和表5。

表3 Plackett-Burman實驗設計與結果

Table 3 The Plackett-Burman experiment design and results

實驗號ABCDEFG菌體數(×108個/mL)111-111-117032-1-1111-118253-11-1-1-11161641-1-1-1111566511-11-1-1-15646111-111-194271-111-11-16568-1-1-1-1-1-1-147591-11-1-1-1154210-111-11-1-179611-1-1-1111-157412-1111-111836

由表4可看出,該回歸模型的p值(prob>F)為<0.0001,為高度顯著,表明該模型在所得回歸區域擬合很好。且酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的p分別為0.025、0.010和0.038,均小于0.05,表明酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4在95%的置信區間內顯著,是影響丁酸梭菌菌體量的三個主要因素,且全為正效應;其余因素的p值均大于0.05,表明在95%的置信區間內是不顯著,對菌體量影響不大,可以通過后面的最低添加量實驗來確定這些非顯著因素的添加量,以降低成本。由表5看出,該回歸模型的p值在95%的置信區間內是顯著的,其決定系數R2=92.02%,表示模型中92.02%的數據都能用此模型來解釋。

2.3 最陡爬坡實驗結果分析

根據PB實驗的回歸分析和方差分析,按照各因素的正負效應來設定最陡爬坡實驗:酵母浸粉、FeSO4、K2HPO4均為正效應,步長分別設為5、2、0.3 g/L，詳見表6。

表6 最陡爬坡實驗設計與結果

Table 6 Experiment design and results of the steepest ascent design

項目酵母浸粉(g/L)(+)FeSO4(g/L)(+)K2HPO4(g/L)(+)菌體數(×108個/mL)原點401225步長5203實驗運行140122578524514288333501631876455183490356020378136652240795

由表6可知,隨著實驗序的進行,第4組丁酸梭菌的菌體數最高,即酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的用量分別為55、18 g/L和3.4 g/L時,菌體數為9.03×108個/mL,隨著運行序的進一步增加,丁酸梭菌的菌體數逐漸降低。故選酵母浸粉、FeSO4和K2HPO4的添加量分別為55、18 g/L和3.4 g/L作為中心復合設計的中心點。

圖10 最低添加量的實驗設計與結果Fig.10 The design and result of minimum amount

2.4 最低添加量實驗

由PB實驗得到的4個不顯著因素可溶性淀粉、NaCl、MgSO4和CaCO3做最低添加量實驗,以期達到培養基成分最優最小的用量。

由圖10a可知,隨著可溶性淀粉添加量的增加，丁酸梭菌菌體密度逐漸增加,當添加量為20 g/L時,菌體數達到最大值9.03×108個/mL;由圖10b可知,NaCl的添加量為2 g/L時,丁酸梭菌菌體密度達到最大值9.01×108個/mL,而繼續增加NaCl用量后菌體數開始下降,故選擇NaCl的添加量為2 g/L;由圖10c可知,隨著MgSO4添加量的逐漸增加,其菌體數也隨著升高,在0.24 g/L時達到最大;由圖10d可知,隨著CaCO3含量的增加,丁酸梭菌菌體密度基本趨于平衡,為節省成本,故選擇CaCO3添加量為0 g/L。故最終確定可溶性淀粉、NaCl、MgSO4、CaCO3的添加量分別為20、2、0.24、0 g/L。

2.5 中心復合實驗設計

根據最陡爬坡實驗得到中心復合實驗的中心點:選酵母浸粉55 g/L、FeSO418 g/L、K2HPO43.4 g/L。以此為中心點,以丁酸梭菌菌體數為響應值進行3因素5水平的中心復合設計實驗。其設計及結果見表7。

表7 中心復合實驗設計與結果

Table 7 Design and result of Central composite design

實驗號ABC菌體數(×108個/mL)111-1892-1-11931-1-19524-1-1-181250-1680818600093470009448-168009391680010881000094511-1119611200-168828131118941400010115000998160016889417-11-1801181-111021900010232001680787

響應面分析中對CCD實驗結果進行擬合二次模型方差分析如表8,模型的p值(prob>F)小于0.05,說明模型具有顯著性,該二次模型多元相關系數R2=90.17%,表明該模型能解釋90.17%的菌體密度變化;失擬項p值為0.6415大于0.05,表明失擬項不顯著,沒有失擬現象。A、C、B2、C2的p值均小于0.05表明對菌體密度的影響呈顯著性,AB之間的交互影響顯著。

根據軟件分析,以Y為菌體數,A為酵母浸粉,B為FeSO4,C為K2HPO4,用多項式回歸技術對此實驗數據擬合所得二次多項式回歸方程為:Y(×108)=9.75+0.40A-0.14B+0.32C-0.30AB-0.22AC+0.010BC+0.16A2-0.57B2-0.37C2,該二次多項式方程的三維響應面圖見圖11～圖13。

由圖11可知,當FeSO4添加量不變時,隨著K2HPO4含量的增加,菌體數出現了先增大后減小的趨勢。同樣,當K2HPO4含量不變時,隨著FeSO4添加量的增加,菌體數也出現了先增大后減小的趨勢。由圖12可知,當酵母浸粉添加量不變時,FeSO4添加量對菌體數存在二次效應,其曲面呈現拋物面。由圖13可以看出K2HPO4和酵母浸粉之間的交互作用不是很明顯。

表8 響應面二次式模型的方差分析表

Table 8 ANOVA Table of response surface quadratic model

項目平方和自由度均方F值p值顯著性Model11929132101900006顯著A酵母浸粉2212216900021?BFeSO402610262040184Ck2HPO41361136104700089?AB071107154500418?AC03910392980115BC800E-041800E-04616E-030939A203510352701315B24751475365500001?C21941194149600031?殘差1310013失擬項054501107106415非顯著純誤差0765015總離差132219R2=9017% R2Adj=8132%

對圖11～圖13分析可知,菌體數達到最大時,三個因素的編碼值分別為1.00(A)、-0.38(B)、0.13(C),即酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.34%,得到此模型的一個最大響應值為1.04×109個/mL,為了驗證此模型預測的準確性,在優化后的培養基進行了驗證,共進行了三次實驗,其平均值為1.01×109個/mL,實測值與回歸方程預測值相對誤差很小。由此可見,用該回歸模型優化丁酸梭菌發酵工藝進行的分析和預測是可行的,且具有實用價值。最終優化后丁酸梭菌發酵培養基為:可溶性淀粉2%,酵母浸粉6%,FeSO41.74%,K2HPO40.34%,NaCl 0.2%。

圖11 磷酸氫二鉀和硫酸亞鐵的交互作用對菌體數影響的響應面圖Fig.11 Response surface for interaction effects of K2HPO4 and FeSO4 on cells

圖12 硫酸亞鐵和酵母浸粉的交互作用對菌體數影響的響應面圖Fig.12 Response surface for interaction effects of FeSO4 and Yeast extract powder on cells

圖13 磷酸氫二鉀和酵母浸粉的交互作用對菌體數影響的響應面圖Fig.13 Response surface for interaction effects of K2HPO4 and Yeast extract powder on cells

3 結論

本研究首先采用單因素實驗對丁酸梭菌培養基及培養條件進行了優化,確定了最佳培養基組份:可溶性淀粉2%,酵母浸粉4%,FeSO41.2%,NaCl 0.3%,K2HPO40.25%,MgSO40.024%,CaCO30.1%,在此基礎上利用PB實驗設計篩選出了影響丁酸梭菌生長的3個顯著性因素即:酵母浸粉、FeSO4、K2HPO4,隨后進行最陡爬坡實驗找出CCD實驗的中心點,最后利用響應面法分析確定丁酸梭菌最佳培養成份為:可溶性淀粉2%,酵母浸粉6%,FeSO41.74%,K2HPO40.34%,NaCl 0.2%,MgSO40.024%,菌體數達到1.01×109個/mL,較之初始發酵培養基提高了4.39倍,為工業上丁酸梭菌微生態制劑大規模生產提供了有價值的參考。

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Optimization of fermentation process forClostridiumbutyricumusing response surface methodology

XING Hong-guan,LIN Jian-guo,ZHONG Xue-zhao,WANG Chang-gao,DU Xin,CAI Jun*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Responsesurfacemethodology(RSM)wasemployedtooptimizefermentationprocessforimprovingthebiomassofClostridium butyricumm.Onthebasisofsinglefactorexperiment,factorswhichinfluencedthebiomassofClostridium butyricummsignificantlywerescreenedbyPlackett-Burmandesign.Onthisbasis,thesteepestascentexperimentwasappliedtofindoutthecenterpointofcentralcompositedesignandtheminimumamountexperimentwasusedtoreducethecostofnon-significantfactors.Finally,themaximumresponsevaluewasidentifiedbyCCD.Theresultsshowedthat:Yeastextractpowder,FeSO4andK2HPO4werethethreefactorsinfluencingthebiomassofC. Butyricummsignificantly,solublestarch2%,yeastextractpowder6%,FeSO41.74%,K2HPO40.37%,NaCl0.2%andMgSO40.024%werethebestcombinationofmediumcomponent,thebiomassofClostridium butyricumreached1.01×109cells/mLwhichwas4.39timesthatofthebiomassbeforeoptimization.

Clostridium butyricumm;biomass;RSM;fermentationprocess

2016-03-14

邢宏觀(1989-)，男，碩士，研究方向:發酵過程優化與放大，E-mail:759211628@qq.com。

*通訊作者:蔡俊(1968-)，男，博士，教授，研究方向：發酵過程優化與放大，E-mail:hgcaijun@126.com。

TS201.3

B

1002-0306(2016)19-0237-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.038