納豆芽孢桿菌生產維生素K2的連續發酵工藝優化

牟 杰,印澤遠,王 麗,周凌蕓,張綺悅,李妙然,閆冬雷,姜 珊

(1.徐州醫學院藥學院,江蘇徐州 221004;2.江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室,江蘇徐州 221004)

?

納豆芽孢桿菌生產維生素K2的連續發酵工藝優化

牟 杰1,2,印澤遠1,+,王 麗1,周凌蕓1,張綺悅1,李妙然1,閆冬雷1,姜 珊1

(1.徐州醫學院藥學院,江蘇徐州 221004;2.江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室,江蘇徐州 221004)

為優化維生素K2的高密度連續發酵生產工藝,通過對納豆芽孢桿菌發酵培養,研究了培養基組成、轉速、pH、溶氧量、后處理技術等因素對維生素K2產量的影響。實驗結果表明以香菇菌渣復配蛋白胨為氮源(5%),甘油為碳源(5%),pH為7,通氣比大于1.5 vvm,轉速為600 r/min時,采用高密度連續發酵技術,5 L罐發酵產量最高達35.58 mg/L。發酵液萃取后,廢液再通過納濾膜截流,提高維生素K2回收率,并制成富含維生素K2的菌菇粉。維生素K2的結構經高效液相及質譜確證。大鼠急性毒性實驗證明該菌菇粉產品安全無毒。

維生素K2,連續發酵工藝,納豆芽孢桿菌

維生素 K2(Vitamin K2,VK2)是甲萘醌類脂溶性維生素,可以通過調節體內鈣離子沉積,促進骨組織內骨鈣素(BGP)的合成,預防和治療骨質疏松癥[1-3]。VK2的異構體根據其分子結構上C-3位異戊二烯單位的個數,以MK-n表示,其中MK-7生物活性最高。目前研究和開發的VK2制備方法主要包括化學合成法[4]和微生物發酵法,但天然VK2(MK-7)僅能通過微生物發酵法獲得[5]。納豆芽孢桿菌因其生長速度快、易于培養、VK2含量高等優勢[6],成為發酵生產VK2最主要的微生物,是目前進行工業化生產VK2的理想物種之一。雖然眾多研究人員開展了微生物發酵生產VK2的研究[7-10],但發酵技術仍不成熟。針對發酵過程中生物量低、生產速率低等問題,本研究對納豆芽孢桿菌連續發酵生產VK2的培養基組成及發酵條件進行優化,簡化操作單元,達到提高最終菌體生物量和目標產物的產率的目的,以期為VK2的大規模工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素K2標準品 昆明骨康保健品有限公司;香菇菌渣 徐州農業科學研究所;其余試劑 市售,分析純;納豆芽孢桿菌R127(CCTCC M2014405)(Bacillussubtilisnatto) 由南京工業大學黃和課題組提供;實驗動物 SD大鼠,SPF級,雌雄各半,雌者無孕,體質量(200±20) g,由徐州醫學院實驗動物中心提供;固體培養基 30 g葡萄糖,40 g蛋白胨,5 g NaCl,5 g牛肉膏,5 g酵母膏,20 g 瓊脂,1000 mL水。115 ℃滅菌30 min;液體培養基 50 g/L甘油,50 g/L大豆蛋白胨,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,溶劑為水。121 ℃滅菌30 min;香菇菌渣培養基 50 g/L甘油,50 g/L 香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃滅菌30 min;香菇菌渣與蛋白胨復配培養基 50 g/L 甘油,15 g/L大豆蛋白胨,50 g/L香菇菌渣,0.6 g/L酵母粉,0.3 g/L K2HPO4,0.1 g/L CaCl2·2H2O,0.3 g/L MgSO4·7H2O,1000 mL水。120 ℃滅菌30 min。

高壓蒸汽滅菌鍋 北京盛達生物電子設備有限公司;Sorvall 離心機 美國科峻儀器公司;MAPADA UV-3100型紫外可見分光光度儀 上海美譜達儀器有限公司;5 L發酵罐Biostat B德國貝朗生物系統公司;LPG-25 噴霧干燥機 常州市利君干燥工程有限公司;UltiMate 3000 型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Finnigen-LCQ Advantage MAX液質聯用儀 美國Finnigan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的培養與處理 菌種的活化:將保存在甘油管的納豆芽孢桿菌接入固體培養基中進行接種活化(pH7.0～7.2,37 ℃,24 h)后進一步轉移到液體培養基中進行搖瓶培養(pH7.0～7.2,37 ℃,120 r/min),液體培養至第二代即可進行發酵生產。

發酵生產:將二級種子接入裝有液體培養基的發酵罐中,接種量10%(v/v),加入消泡劑,維持pH在7.0左右,通氣量1.5 vvm,攪拌轉速200 r/min,罐溫37 ℃,培養60 h,發酵生產VK2。

1.2.2 生物量檢測方法 生物量通過紫外分光光度計測定,每隔24 h測定一次OD600值,以未發酵的培養基作為對照,OD值達60以上為高密度。

1.2.3 高密度發酵工藝優化 將活化的納豆芽孢桿菌接入裝有100 mL香菇菌渣與蛋白胨復配培養基的500 mL搖瓶中,150 r/min,37 ℃進行發酵。當OD600值大于2時可以作為5 L發酵罐的菌種。按照10%接種量將活化后的芽孢桿菌接入裝有復配培養基的5 L發酵罐中,按低轉速200 r/min和高轉速600 r/min兩個條件分別發酵,通氣量均為1.5 vvm,溫度37 ℃,待甘油濃度降低至5 g/L左右時,結束發酵,稱量生物量,檢測VK2(MK-7)含量。

1.2.4 VK2(MK-7)的定性與定量檢測 將10 mL納豆芽孢桿菌發酵液移入250 mL帶擋板的錐形瓶中,向發酵液中加入異丙醇和正己烷的混合液(1∶2∶4,v∶v),在搖床上220 r/min震蕩30 min,靜置分層后,取上清旋蒸,記錄產物的質量,將所得的產物用異丙醇洗出,定容到10 mL的棕色容量瓶中。用液相色譜或質譜進行定性和定量分析。

VK2的定性通過被檢測樣品與標準VK2樣品在液相色譜上洗脫位置的比較以及樣品在質譜圖上的離子碎片的特征表現來確定。

VK2的定量通過VK2標準品的濃度與液相色譜中對應峰面積的標準曲線計算而得。

液相色譜工作條件為:色譜柱:Brava-BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱;流動相:100%甲醇;流速:1.0 mL/min;進樣量:30 μL;柱溫:50 ℃;檢測波長:270 nm。

質譜測定時液相色譜的工作條件同上,質譜采用ESI全掃描檢測。

1.2.5 富含VK2的菌菇粉制備 將發酵液通過微濾膜濃縮設備,回收菌體濃縮液,并收集濾出清液;將濾出的清液通過納濾膜濃縮設備,截留分子量300 u以上的物質,回收截留濃縮液,濾出清液經處理后排放。合并菌體濃縮液和截留濃縮液,采用噴霧干燥機制粉。

1.2.6 大鼠急性毒性實驗 取20只SPF級SD大鼠,隨機分成給藥組和空白對照組,每組10只,禁食不禁水12 h。給藥組按大鼠最大灌胃給藥體積100 mg/kg給予供試品(即富含VK2的菌菇粉),每天2次,空白對照組給予等體積的生理鹽水。常規飼養14 d,記錄動物體質量變化、外觀、飲食、行為、排泄物及中毒反應等情況。第14 d時稱重處死,解剖小鼠,肉眼觀察其心、肝、肺、腎的外觀。

2 結果與分析

2.1 VK2(MK-7)的定性和定量分析

取納豆芽孢桿菌發酵液適量,按1.2.4方法提取其中的VK2(MK-7),并對提取液用液質聯用(LC-MS)分析。液相色譜圖見圖1,圖中保留時間為40.777 min的吸收峰與VK2(MK-7)標準品(圖2)的保留時間一致。對液相色譜中的VK2特征峰進行質譜分析,結果如圖3所示。從圖3可以看出特征峰的分子量為649.3(M+1),與MK-7的分子量一致,說明液相色譜中40.777 min處的特征峰為本研究的目標產物VK2(MK-7)。

圖1 發酵樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC of VK2(MK-7)in the fermentation sample

圖2 100 mg/L VK2(MK-7)標準品的液相色譜圖Fig.2 HPLC of VK2(MK-7)standard sample

圖3 發酵樣品VK2(MK-7)質譜圖Fig.3 Mass spectrum of VK2(MK-7)

按照VK2的色譜檢測條件,配制不同濃度梯度的VK2(MK-7)標準溶液,以進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。從圖4中可以看出,MK-7標準曲線具有良好的線性關系,其線性回歸方程為Y=0.7101X-0.3223,R2=0.9986,檢出限為1 μg。在此色譜條件下,可以檢測不同發酵周期的發酵液中VK2的質量濃度。

圖4 VK2(MK-7)標準曲線Fig.4 Standard calibration curve of VK2(MK-7)

2.2 氮源的優化

本實驗以甘油為碳源,對氮源進行了優化。從文獻中可以知道,大豆蛋白胨是合成MK-7 的最佳氮源[11],但價格較高。為了降低生產成本,最好能選擇更便宜的氮源。本實驗按1.2.1的方法,通過檢測VK2的產量來考察以香菇菌渣作為替代氮源的可行性,同時將香菇菌渣和蛋白胨復配,考察了部分替代的可行性(表1)。

從表1可以看出,大豆蛋白胨合成VK2含量最高,確實是最佳氮源。雖然香菇菌渣的含氮量與大豆蛋白胨相近,但發酵效果遠不如蛋白胨;而以香菇菌渣與蛋白胨復配物為氮源時,VK2產量雖明顯高于單獨以香菇菌渣為氮源的情況,但仍低于蛋白胨。為提高VK2產量,本實驗以香菇菌渣為主要氮源,蛋白胨作補充氮源,通過優化高密度發酵工藝參數來提高VK2產量。

表1 不同氮源對VK2產量的影響

Table 1 The effects of different nitrogen source on the yield of vitamin K2

培養基種類大豆蛋白胨干重(g/L)菌菇粉干重(g/L)MK-7(mg/L)液體培養基520701705香菇菌渣培養基05325295香菇菌渣與蛋白胨復配培養基15365067649

2.3 高密度連續發酵工藝的優化

采用香菇菌渣與大豆蛋白胨復配發酵培養基,按1.2.3的方法,在5 L發酵罐上開展納豆芽孢桿菌高密度連續發酵產VK2的工藝優化研究。在5 L發酵罐中,當OD600保持在80左右,說明發酵罐中的菌種生物量較大,可視為高密度發酵。當培養基中甘油濃度降低至5 g/L左右時,結束發酵。然后按1.2.4的方法,用液相色譜檢測VK2(MK-7)的產量。

本實驗首先考察了轉速(低轉速200 r/min和高轉速600 r/min)對發酵生產VK2的影響,不同轉速下對甘油消耗的影響結果見圖5,發酵時間對VK2產率的影響見圖6。

從圖5可以看出:轉速對VK2產量影響很大。低轉速(200 r/min)下,甘油消耗速度慢,發酵被抑制;高轉速(600 r/min)下,甘油消耗速度較快,發酵60 h后,甘油被消耗完全,繼續延長發酵時間,甘油消耗量變化不大。

圖5 5 L發酵罐不同轉速對甘油消耗的影響Fig.5 Effects of different rotate rate on the consumption of glycerol in 5 L fermentation tank

從圖6可以看出:VK2的產量隨發酵時間延長而增加,發酵60 h后達峰值,隨著發酵時間延長而VK2產率反而降低;高轉速(600 r/min)下發酵60 h后,VK2產量最高可達35.58 mg/L。

圖6 5 L發酵罐中發酵時間對VK2產量的影響Fig.6 Effects of fermentation time on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

然后考察了不同轉速下溶氧(DO)對兩種培養基發酵時間的影響(圖7)。從圖7可以看出:發酵20 h后,DO值大于20%,對復配氮源的高轉速發酵更為有利。

圖7 5 L發酵罐中溶氧對VK2產量的影響Fig.7 Effects of DO value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

圖8為酸堿度對不同轉速下兩種培養基發酵時間的影響,從圖中可以看出:高轉速下復配氮源的發酵pH在發酵20～80 h之間較為穩定,保持在7左右,pH突然降低說明需要補料。

圖8 5 L發酵罐中酸堿度對VK2產量的影響Fig.8 Effects of pH value on yield of VK2 in 5 L fermentation tank

結合培養基的優化及高密度連續發酵工藝的優化,得出最佳工藝條件為:以甘油為碳源,香菇渣與蛋白胨復配物為氮源,控制DO大于20%,通氣量為1.5 vvm,600 r/min,溫度37 ℃,pH7.0時,VK2發酵產量最高,可達35.58 mg/L。

2.4 富含VK2的菌菇粉制備方法

將發酵液經管式分離膜過濾,獲得固形物含量20%以上的濃縮液,然后用卷式納濾膜截留剩余發酵液中的VK2,可提高收率。將濃縮液和截留物與香菇菌渣、灰樹花渣等菌菇渣經噴霧干燥器進行噴干制成干粉,可獲得每克富含200 μg維生素K2的菌菇粉。

2.5 大鼠急性毒性實驗

在連續14 d的觀察中,大鼠外觀、飲食、行為、排泄均未出現異常癥狀,也無死亡;處死后進行解剖,各器官未見異常。富含K2菌菇粉對雌、雄性大鼠經口LD50均大于2000 mg/kg體重,屬無毒級。

組別給藥前體質量(g)給藥14d后體質量(g)體質量增長的百分率(%)空白對照組200±20260±182636富含VK2的菌菇粉組202±20264±162612

3 結論與討論

在納豆芽孢桿菌的發酵過程中,合適的氮、碳源以及氮碳比對維生素K2發酵具有重要作用。Yoshiki等發現以甘油為碳源、以蛋白胨為氮源的培養基中MK-7的產量和細胞增長速度都為最高[11]。由于蛋白胨的價格較高,造成生產成本過高,因此有必要尋找一種新的廉價的氮源。采用含氮量相近、成本低的香菇菌渣替代蛋白胨,可以“變廢為寶”,提高資源利用率。本實驗發現單獨用香菇菌渣作氮源,生物量低,VK2收率低;但向香菇菌渣中加入過多的蛋白胨作復配氮源時,發酵體系中會產生大量泡沫,對底物消耗也會產生一定的抑制作用[12]。因此本實驗采用50 g/L香菇菌渣和15 g/L的大豆蛋白胨的復配物作氮源。

納豆芽孢桿菌是好氧菌,在小體系比大體系生產VK2能力更強,這可能是在大發酵體系中供氧不足,導致細胞代謝速率減緩,VK2生產力下降。通過在5 L發酵罐中對高密度發酵工藝參數的考察,我們發現高轉速(600 r/min)、高溶液溶氧量(DO>20%)時,發酵60 h,VK2收率最高達35.58 mg/L。反應體系的pH控制在7左右,有利于高轉速下復配氮源的發酵的平穩進行。同時,隨著發酵時間的延長,發酵體系pH會突然降低,VK2產量隨之下降,因此檢測發酵體系的pH可以作為補料的依據。

發酵產生的VK2位于細胞膜上,在發酵過程中部分產品滲漏進入發酵液中,因此采用納濾膜過濾發酵液,可以截留分子量100～1000的物質,提高VK2的收率。將VK2與香菇渣、灰樹花渣等菌菇渣經噴霧干燥器進行噴干作成干粉,可以獲得每克富含200 μg維生素K2的菌菇粉。該菌菇粉在急性毒性實驗中,未見任何急性毒性反應,對大鼠LD50均大于2000 mg/kg體重,屬無毒級。

本文報道的納豆芽孢桿菌高密度連續發酵生產維生素K2的工藝在氮源、工藝參數、產物劑型上均進行了改進,為VK2的工業化大生產提供了理論依據。

[1]Wu W J,Kim M S,Ahn B Y. The inhibitory effect of vitamin K on RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption[J]. Food Funct,2015,6(10):3351-3358.

[2]Abdel-Rahman M S,Alkady E A,Ahmed S. Menaquinone-7 as a novel pharmacological therapy in the treatment of rheumatoid arthritis:A clinical study[J]. Eur J Pharmacol,2015,761:273-278.

[3]Inaba N,Sato T,Yamashita T. Low-Dose Daily Intake of Vitamin K2(Menaquinone-7)Improves Osteocalcinγ-Carboxylation:A Double-Blind,Randomized Controlled Trials[J]. J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo),2015,61(6):471-480.

[4]Schurgers L J,Teunissen K J,Hamulyak K,et al. Vitamin K-contain dietary supplements:comparison of synthetic vitamin K1 and natto-derived menaquinone-7[J]. Blood,2007,109(8):3279-3283.

[5]Berenjian A,Mahanama R,Talbot A,et al. Efficient media for high menaquinone-7 production:response surface methodology approach[J]. N Biotechnol,2011,28(6):665-672.

[6]Berenjian A,Chan NL,Mahanama R,et al. Effect of biofilm formation by Bacillus subtilis natto on menaquinone-7 biosynthesis[J]. Mol Biotechnol,2013,54(2):371-378.

[7]Bentley R,anathan R. Biosynthesis of vitamin K(menaquinone)in bacteria[J]. Microbiol Rev,1982,46:241-280.

[8]Ebrahiminezhad A,Varma V,Yang S,et al. Magnetic immobilization of Bacillus subtilis natto cells for menaquinone-7 fermation[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(1):173-180.

[9]Yoshinori T,Makoto K,Hirpyuki K. Construction of a bacillus subtilis with high productivity of vitamin K2(menaquinone2-7)by analog resistance[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2001,65:2007-2015.

[10]Toshiro S,Yohko Y,Yutaka O. Production of menaquinone(vitamin K2)-7 by bacillus subtilis[J]. J Biosci Bioeng,2001,91:16-20.

[11]Yoshiki T,Naoki S. Menaquinone-4 production by a mutant of flavobacterium sp.238-7[J]. Agricultural & Biological Chemistry,1987,51(9):2409-2415.

[12]Hiroshi H,Makoto U,Kenichi I,et al. Lysocin E is a new antibiotic that targets menaquinone in the bacterial membrane[J]. Nature Chemical Biology,2015,11(2):127-133.

Optimization on the continuous fermentation process of Vitamin K2 fromBacillussubtilisnatto

MOU Jie1,2,YIN Ze-yuan1,+,WANG Li1,ZHOU Ling-yun1, ZHANG Qi-yue1,LI Miao-ran1,YAN Dong-lei1,JIANG Shan1

(1.School of Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China; 2.Jiangsu Key Laboratory of New drug and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China)

TooptimizethehighdensitycontinuousfermentationprocessofVitaminK2,theeffectsofrawmaterialsconcentration,rotationrate,pH,dissolvedoxygen(DO)andpost-processingtechniqueswereinvestigatedbythefermentationofBacillus subtilis natto.ItwasfoundthattheoptimalconditionwasofGlycerol5%,soybeanprotein2%,mushroomcompost3%,pH7andDOof20%at600r/min.Thehighestyieldreached35.58mg/Lin5Lfermentationtank.Mushroomcompost,asasupplementarynitrogensource,canpromotethebiosynthesisofVK2,anditseffectiveconcentrationwas3%.Thefermentationbrothwasextractedbyextractliquorandfilteredbynanofiltrationmembrane.Asaresult,VitaminK2canbewellisolatedandtheVK2mixedmushroompowderwasobtainedthroughspraydrying.ThestructureofVitaminK2wascharacterizedbyHPLCandMS.Thequalityofproductwassafeandqualified.

VitaminK2;continuousfermentationprocess;Bacillus subtilis natto

2016-04-05 +為并列第一作者

牟杰(1974-),女,博士,副教授,研究方向:藥物合成,E-mail:mou.jie@126.com。 印澤遠(1998-),男,本科生,研究方向:抗腫瘤藥物研發,E-mail:2504464354@qq.com。

國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510313028);江蘇省大學生實踐創新訓練計劃重點項目(201510313028Z);江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室主任基金(ZR-XY201403);徐州醫學院“振興計劃”。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.022