檢測豬口腔液中藍耳病抗體時不同采集和處理方法的比較

李守剛，沈強，瞿慧，余紅梅，衛秀余

（上海市奉賢區動物疫病預防控制中心，上海奉賢201499）

檢測豬口腔液中藍耳病抗體時不同采集和處理方法的比較

李守剛，沈強，瞿慧，余紅梅，衛秀余

（上海市奉賢區動物疫病預防控制中心，上海奉賢201499）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是對養豬業有重大影響的頑固性疾病。臨床上表現為懷孕母豬發生流產、早產、死胎等繁殖障礙，仔豬和肥育豬出現呼吸衰竭，并伴隨生長緩慢，流行范圍廣，病死率高。血液中的PRRS抗體檢測在疾病診斷、免疫水平評估中有著重要作用。但血液樣品采集有工作量大、對動物造成傷害、威脅采集人員安全等缺點。近年來有報道利用口腔液檢測PRRS抗體，結果與血液中PRRS抗體含量具有很好的相關性。而本試驗主要比較不同的樣品采集處理方法對結果的影響，結果顯示，口腔液的稀釋倍數對檢測結果影響較大，因此必須選擇敏感性較高的檢測試劑盒，如藍耳病抗體檢測試劑盒血清40倍稀釋時，與口腔液2倍稀釋的結果才有較高的相關性。

藍耳病抗體；豬口腔液；樣品處理

口腔液是一種唾液和黏膜滲出液的混合物，口腔液中的唾液主要由腮腺、頜下腺和舌下腺這3條唾液腺共同分泌，黏膜滲出物則是通過毛細血管穿越頰黏膜到達口腔，口腔液中包含來自血清和唾液腺的特異性抗體[1]。唾液中起作用的抗體主要有兩種，分泌型IgA（sIgA）和IgG。分泌型IgA由唾液腺的漿細胞分泌，而唾液中絕大多數的IgG來自血清，也有一些IgG是局部產生的[2]。使用口腔液進行疾病診斷和健康評估在人醫上已經得到廣泛運用，口腔液可以作為麻疹、腮腺炎、肝炎等疾病初步診斷分析的樣品[3]。使用口腔液在動物疾病檢測和疫病監測的研究剛剛開始。口腔液樣品可用于PCR檢測抗原，如口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、經典豬瘟病毒、流感病毒、藍耳病病毒、圓環病毒2型、丹毒絲菌屬、胞內勞森氏菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體以及其他的一些病原體。口腔液樣品同時可以替代血清樣品檢測藍耳病抗體、圓環病毒2型抗體、口蹄疫抗體、偽狂犬病抗體、豬瘟抗體[4]、非洲豬瘟抗體[5]等。目前為止，口腔液在獸醫領域運用最成熟的是藍耳病抗體的檢測[5]。口腔液成分復雜、在體外容易接觸污染源、抗體含量比血液低等是影響口腔液作為可靠樣品的因素。筆者于2013年10月至2015年10月在上海奉賢某豬場通過比較不同的口腔液采集和處理程序，降低不利因素的影響，以增加口腔液樣品與血清樣品中藍耳病抗體檢測結果的符合率和穩定性。

1 材料與方法

1.1 采樣工具

采血器，直徑1.6 cm棉繩，密封袋，5 mL和1.5 mL離心管。

1.2 藥品試劑

蛋白酶抑制劑，IDEXX藍耳病血清抗體檢測試劑盒。

1.3 樣品采集

從免疫過藍耳病疫苗的豬場采集50份母豬血、20份公豬血，-20℃保存血清。每頭采集過血液樣品的豬，采集對應的口腔液樣品，50份來自母豬、20份來自公豬。采集10份藍耳病抗體陰性的豬血和對應的10份口腔液樣品。

1.4 口腔液采集

在投飼前，取直徑1.6 cm長度1.5 m的棉繩，將兩端松散，兩端下垂懸掛在飼喂欄上，繩子盡量離開地面和污染的欄柱，繩子末端略高于豬嘴，保證豬容易接觸，讓豬自由咀嚼30 min，將棉繩濕潤的末端放入密封袋，用力擠壓，將口腔液轉入離心管中。采集的量在2～5 mL，足夠多次檢測所用。將樣品低速離心5 min，吸取上清液。

1.5 口腔液處理

將吸取的上清液分為兩份，一份加入蛋白酶抑制劑，一份不加，樣品放入-20℃保存。

1.6 血液樣品檢測

用樣品稀釋液將血清40倍稀釋，取100 μL對照和樣品加入反應板，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL酶，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL底物，24℃避光反應15 min，650 nm波長讀數。

1.7 口腔液樣品檢測

口腔液樣品不稀釋或2～8倍稀釋，取100 μL對照、100 μL含蛋白酶抑制劑和不含蛋白酶抑制劑的稀釋樣品加入反應板，24℃孵育120 min，洗板3次，加入100 μL酶，24℃孵育30 min，洗板3次，加入100 μL底物，24℃避光反應15 min，650 nm波長讀數。其中未冷凍樣品于采集后24 h內進行檢測，第1次解凍樣品為冷凍后2周進行檢測，第2次解凍樣品于冷凍后4周進行檢測。

2 結果與分析

2.1 血清樣品與口腔液樣品檢測結果比較

檢測結果表明，血清樣品與口腔液樣品的結果具有較高的相關性，陰性符合率100%（10/10），陽性符合率94%（66/70）以上（表1）。

表1 血清樣品與口腔液樣品檢測結果比較（口腔液2倍稀釋）份

2.2 口腔液樣品中蛋白酶抑制劑對檢測結果的影響

結果顯示，加入蛋白酶抑制劑的樣品未冷凍與第1次解凍和第2次解凍后檢查結果的陽性符合率分別為100%和98%；而不加蛋白酶抑制劑的樣品其陽性符合率僅為98%和94%（表2）。說明蛋白酶抑制劑在反復檢測或者保存較長時間時，能增加樣品的穩定性。不使用蛋白酶抑制劑的樣品在采集后應盡快檢測。

表2 口腔液樣品中蛋白酶抑制劑對檢測結果的影響份

2.3 稀釋倍數對結果的影響

表3檢測結果顯示，口腔液樣品不稀釋或2倍稀釋時，其與血清抗體的陽性符合率為94%（66/70）；而4倍和8倍稀釋時、其陽性符合率僅為43%（30/ 70）和14%（10/70）。說明稀釋倍數大于2倍時，其陽性檢出率會明顯下降，這和試劑盒的敏感性有關。

表3 稀釋倍數對結果的影響份

3 討論

（1）口腔液的采集方法簡便，易學易用，速度快，費用低，并可減少應激，改善動物福利，是評估豬群實時健康動態的良好工具[6]。

（2）口腔液采集最好選用棉繩，自由咀嚼30 min就能獲得足夠的樣品。采集口腔液樣品時應該嚴格防止樣品污染，樣品需長期保存時可以加入蛋白酶抑制劑。

（3）口腔液中藍耳病抗體與血清中的藍耳病抗體具有很好的相關性，可以用于監測豬群的感染狀態和免疫效果[7]。

（4）口腔液的稀釋倍數對檢測結果影響較大，因此必須選擇敏感性較高的檢測試劑盒，如藍耳病抗體檢測試劑盒血清40倍稀釋時，與口腔液2倍稀釋的結果才有較高的相關性，口腔液稀釋倍數大于4倍以上時其檢測結果已無實際意義。

（5）推進口腔液在獸醫檢測中的運用還有許多問題：包括制作專門的采集用具，降低檢測的成本；研發針對其他抗體的試劑盒，擴大使用范圍；提高檢測的精密度，能夠更好地反映口腔液中抗體濃度的變化。

[1]孫泉云，夏爐明，盧軍，等.豬口腔液在疫病檢測上的應用進展[J].國外畜牧學-豬與禽，2015（6）：37-38.

[2]李慧，宋明則，張建明，等.豬免疫后唾液中豬瘟抗體水平的監測[J].中國畜牧獸醫文摘，2014（7）：95-96.

[3]侯亞琴，張建明，李慧，等.豬唾液于血清中抗體相關性研究[J].畜牧業，2014（3）：18-19.

[4]張建明，李慧，陳長寧，等.仔豬口蹄疫母源抗體變化趨勢的研究[J].中國畜牧獸醫文摘，2014（4）：44-45.

[5]Mur L,Gallardo C,Soler A,et al.Potential use of oral fluid samples for serological diagnosis of African swine fever[J].Veterinary Microbiology,2013,165(1/2):135-139.

[6]Prickett J R,Cutler S,Kinyon J M,et al.Stability of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and antibody in swine oral fluid[J].Journal of Swine Health and Production, 2010,18(4):187-195.

[7]White D,Rotolo M,Olsen C,et al.Recommendations for penbased oral-fluid collection in growing pigs[J].Journal of Swine Health and Production,2014,22(3):138-141.

（編輯：富春妮）

睡得太多也會折壽？

芬蘭一項研究發現，睡眠時間過長易短命。研究表明，睡眠時間超過8小時的人，死亡率高出20%；睡眠時間不足5小時和超過8小時的人，都有死亡率增高的危險。每晚睡眠時間都超過8小時的人，發生卒中概率增加30%。研究顯示，睡眠與壽命有一定的聯系，但目前尚不清楚是睡眠過長造成了短壽，還是其他病因導致嗜睡。

（摘自《上海大眾衛生報》，2016-01-26）

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0092-02

2016-02-22

李守剛（1989-），男，云南昭通人，獸醫師，研究方向為動物疫病實驗室檢測技術.

衛秀余，研究員，研究方向為動物疫病實驗室診斷和綜合防治技術.E-mail：13801850960@163.com