抗菌肽在斷奶仔豬飼糧中的應用效果研究

朱宇旌，王博，李方方，鄭麗莉，高原，孟玲，郭福來，丁蘭，張勇

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽110866；2.遼寧德寶農牧集團有限公司，遼寧沈陽110171；3.沈陽福康農牧科技有限公司，遼寧沈陽110164）

抗菌肽在斷奶仔豬飼糧中的應用效果研究

朱宇旌1，王博1，李方方1，鄭麗莉1，高原2，孟玲2，郭福來2，丁蘭3，張勇1

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽110866；2.遼寧德寶農牧集團有限公司，遼寧沈陽110171；3.沈陽福康農牧科技有限公司，遼寧沈陽110164）

為研究抗菌肽（AMPs）在仔豬生產中的應用效果，選取（10.30±1.13）kg大白仔豬180頭，隨機分為3組，每組4個重復，每個重復15頭，對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加抗菌肽A（AMPs-A）500 mg/kg和抗菌肽B（AMPs-B）300 mg/kg，試驗期28 d。結果表明：1）AMPs-A組在試驗1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個時間階段日增重比對照組分別提高5.66%（P＞0.05）、3.92%（P＞0.05）、3.85%（P＞0.05）。2）AMPs-A組血清尿素氮水平比對照組降低14.55%（P＜0.01）。3）與對照組相比，AMPs-A、AMPs-B血液中IgG分別提高2.07%（P＜0.05）、1.27%（P＜0.05），血清總蛋白水平分別提高4.48%（P＜0.05）、4.03%（P＜0.05），血液T淋巴細胞轉化率AMPs-A組提高39.02%（P＜0.05）。4）AMPs-A組干物質、粗蛋白質和粗脂肪消化率分別比對照組提高2.62%（P＜0.05）、3.95%（P＜0.05）、3.70%（P＜0.05）。5）腸道中大腸桿菌數，AMPs-A、AMPs-B比對照組分別降低5.53%（P＜0.05）、3.77%（P＜0.05）；乳酸桿菌數，AMPs-A、AMPs-B比對照組分別提高4.94%（P＜0.05）、3.67%（P＜0.05）；雙歧桿菌數，AMPs-A、AMPs-B比對照組分別提高5.61%（P＜0.05）、4.75%（P＜0.05）。綜上所述，在仔豬飼糧中添加AMPs可以有效提高仔豬的生長性能、飼料養分消化利用率，改善血清生理生化指標水平、腸道微生物平衡。綜合本試驗各項指標，仔豬飼糧中添加AMPs-A效果較好。

抗菌肽；斷奶仔豬；生長性能；血清生理生化指標；養分消化率；糞便微生物菌群

目前尋找可替代抗生素類的新型飼料添加劑已成為動物營養領域的研究熱點。抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是指昆蟲及動物體內通過誘導作用產生的一類分子量較小的多肽物質，產生于生物體的免疫系統當中，可以抵抗病原體的侵害，是具有廣譜殺菌功能的一類多肽，屬堿性，同時它也是生物體中天然免疫系統不可分割的重要組成部分[1]。經大量研究發現，抗菌肽具有提高動物生長性能、調節機體免疫性能、改善腸道微生物環境、抗病毒活性等優點[2-4]。但目前有關AMPs在仔豬生產中的應用效果及作用機制少有報道。因此，本試驗以大白仔豬為試驗對象，通過在飼糧中添加不同的AMPs研究其對仔豬生長性能、血液生理生化指標、免疫機能、養分消化率和糞便中微生物菌群的影響，為AMPs在實際生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗菌肽A（AMPs-A）主要成分為豬防御素、蠅蛆殺菌肽、枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌≥1.5×109CFU/g。

抗菌肽B（AMPs-B）主要成分為天蠶素、枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌≥1×109CFU/g。

1.2 試驗動物及飼糧

試驗于2014年4—6月在遼寧德寶農牧集團艾德蒙種豬場進行。大白仔豬平均體重在（10.30±1.13）kg。基礎飼糧參考NRC（1998）配制，其組成及主要營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.3 試驗設計及飼養管理

選用體重相近、健康的大白仔豬180頭，隨機分為3組，每組4個重復，每個重復15頭仔豬。飼喂期28 d。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加500 mg/kg AMPs-A、300 mg/kg AMPs-B。

試驗開始前對保育豬舍進行沖洗及消毒，試驗仔豬采用高床飼養，自由采食及飲水。免疫和驅蟲程序按豬場常規程序進行，隨時觀察、記錄仔豬的采食和腹瀉情況以及每天的飼料消耗量。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 生長性能指標的測定分別在試驗第1天、第14天和第28天以個體為單位對所有試驗豬進行空腹稱重，試驗過程中以重復為單位記錄采食量，并測定仔豬的平均日采食量、平均日增重。根據平均日增重（ADG）和平均日采食量（ADFI）計算料重比（F/G）。

1.4.2 血清生理生化指標的測定采用日本日立7160全自動生化儀測定血清中總蛋白（totalprotein,TP）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）。采用比色法測定IgA、IgG、IgM含量，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.3 T淋巴細胞轉化率的測定取抗凝血3 mL，500 r/min離心10 min，取中層（血漿與血細胞之間的白色膜）加Hank'S液2 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液。洗滌2次。用PRMI 1640稀釋細胞用血球儀計數白細胞，使其密度為107/mL的白細胞懸液，分裝成2管。在一管中加10%小牛血清和10%植物血凝素各100 μL，另一管（對照管）加10%小牛血清和PRMI 100 mL，混勻。取上述100 μL加入96孔板細胞培養板內，設2個重復管，在5%二氧化碳、37℃、飽和濕度下培養48 h，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL培養4 h，再加10 mL 10%的SDS-0.04M HCl，培養2 h后取出，室溫放置5 min。采用酶聯免疫檢測儀檢測[5]。

1.4.4 養分消化率的測定以酸不溶灰分作為內源指示劑測定各養分消化率。在正式試驗期的第26、27和28天選取每個重復中生長較好、體況相近的豬各5頭，連續3 d于6：00至8：00間收集糞樣，每天每頭豬采集糞樣約200 g，并加入體積分數為10%的酒石酸水溶液20 mL，防止氨氣揮發。收集后將每個糞樣單獨冷凍保存，密封后低溫運回實驗室，糞樣進行概略養分分析。測定酸不溶灰分（AIA）含量，計算干物質（DM）、粗蛋白質（CP）、粗脂肪（EE）、鈣（Ca）和磷（P）的表觀消化率[5]。

1.4.5 糞中微生物菌群的測定在正式試驗期的第28天選取每個重復中生長較好、體況相近的豬各5頭，連續3 d于6：00～8：00間收集糞樣，每頭豬采集糞樣約50 g，分別使用無菌自封袋采集封裝記錄后置于-4℃冰箱內保存用于測定大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數量，采用平板涂布法計數[5]。試驗所用培養基均購自青島高科園海博生物技術有限公司，大腸桿菌用麥康凱培養基（HB6238-1）37℃下恒溫需氧培養24 h后計數；乳酸桿菌用乳酸桿菌選擇性瓊脂培養基（LBS培養基，HB0385）、雙歧桿菌用雙歧桿菌瓊脂培養基（BL培養基，HB0395），置于37℃培養箱厭氧培養48 h后觀察計數，結果均以每克糞便中含有的菌落總數的常用對數值[log（CFU/g）]表示。

1.5 數據統計分析

試驗數據經Excel初步處理后采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），差異顯著時采用鄧肯法（duncan）進行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，數據結果以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽對仔豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，AMPs-A組仔豬中期重、末重分別提高3.61%（P＞0.05）、3.89%（P＞0.05），AMPs-B中期重、末重比對照組分別顯著降低4.57%（P＜0.05）、5.65%（P＜0.05）。AMPs-A組有提高日增重趨勢（P＞0.05），試驗1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個時間階段日增重比對照組分別提高5.66%、3.92%、3.85%。但AMPs-B仔豬日增重顯著低于對照組（P＜0.05），試驗1～14 d、15～28 d、1～28 d這3個時間階段日增重比對照組分別顯著降低11.32%、7.84%、9.62%。各試驗組日采食量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），但AMPs-A各試驗階段有高于對照組趨勢。料重比，試驗1～14 d，AMPs-B組顯著高于對照組和AMPs-A組，分別提高8.06%、11.67%；AMPs-A組與對照組相比降低3.23%，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 抗菌肽對仔豬生長性能的影響

2.2 抗菌肽對仔豬血液生化指標的影響

2.2.1 抗菌肽對仔豬蛋白質代謝指標的影響由表3可知，AMPs-A組尿素氮極顯著低于對照組（P＜0.01），AMPs-B組尿素氮顯著低于對照組（P＜0.05），與對照組相比分別降低14.55%和8.18%。

表3 抗菌肽對仔豬蛋白質代謝的影響

2.2.2 抗菌肽對仔豬免疫性能的影響由表4可知，各試驗組血液IgA和IgM含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。AMPs-A組、AMPs-B組與對照組相比，血液IgG含量顯著提高（P＜0.05），分別提高2.07%、1.27%。AMPs-A組血液T淋巴細胞轉化率顯著高于對照組（P＜0.05），比對照組提高39.02%； AMPs-B組血液T淋巴細胞轉化率顯著低于對照組（P＜0.05），比對照組降低9.76%。AMPs-A、AMPs-B組血清總蛋白水平比對照組分別顯著提高4.48%、4.03%。

表4 抗菌肽對仔豬血液免疫指標的影響

2.3 抗菌肽對仔豬養分消化率的影響

由表5可見，與對照組相比，AMPs-A組干物質、粗蛋白質、粗脂肪消化率分別顯著提高2.62%、3.95%、3.70%。AMPs-B組干物質、粗蛋白質、粗脂肪消化率與對照組差異不顯著。AMPs-B組鈣和磷消化率比對照組顯著低6.73%、4.92%，AMPs-A組鈣和磷消化率與對照組差異不顯著。

表5 抗菌肽對仔豬養分消化率的影響

2.4 抗菌肽對仔豬腸道微生物數量的影響

由表6可知，AMPs-A、AMPs-B組腸道中大腸桿菌數量均顯著低于對照組（P＜0.05），分別降低5.53%、3.77%；乳酸桿菌菌落數，AMPs-A、AMPs-B組分別比對照組顯著提高了4.94%、3.67%；雙歧桿菌菌落數，AMPs-A、AMPs-B組分別比對照組顯著提高5.61%、4.75%。

表6 抗菌肽對仔豬腸道微生物數量的影響

3 討論

3.1 抗菌肽與仔豬生長性能的關系

研究發現，斷奶仔豬抵抗力下降，容易引發腹瀉、生長性能下降等，這很可能與抗菌肽的表達下降有關，通過外源性添加抗菌肽可提高畜禽防御功能，增強自身免疫力和抗病能力[5]。在飼糧中添加抗菌肽能夠增加仔豬對外源性病原菌的抵抗能力[5]。本試驗結果表明，在飼糧中添加AMPs-A能顯著地提高仔豬日增重，降低試驗仔豬料重比，但對日采食量無顯著影響，這與Jin等[6]的研究結果相似。AMPs-B組中期重和末重低于對照組，可能是這種抗菌肽反而引起體內免疫反應導致負面效果，所以抗菌肽的種類對仔豬生長性能的影響很大。AMPs-A是來自豬源型的抗菌肽，效果明顯好于對照組和AMPs-B組。

3.2 抗菌肽與仔豬免疫性能及血清生理生化的關系

血清總蛋白含量和尿素氮濃度能夠比較準確地反映出動物體內蛋白質代謝和飼糧氨基酸平衡的狀況[7]。本研究發現，在飼糧中添加AMPs-A能顯著提高仔豬血清中總蛋白水平，極顯著降低仔豬血液中尿素等水平，這與Coma等[8]研究結果相似。這是由于AMPs能促進蛋白質在仔豬體內的合成，降低體內氨基酸的分解作用，從而改善了機體內氨基酸的平衡狀態，促進機體蛋白質的合成或減少體內含氮物質的分解，進而增加機體蛋白質沉積。

顧憲紅等[9]指出，斷奶會使仔豬腸絨毛萎縮、隱窩加深，保護仔豬的胃腸道黏膜可減弱應激對仔豬的損傷作用，而免疫球蛋白在保護腸道、呼吸道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起關鍵作用。本試驗結果表明，添加AMPs-A能夠提高仔豬IgG和IgM水平，進而保護斷奶仔豬胃腸道黏膜，減少斷奶應激，這與Papagianni等[10]的研究結果基本一致。此外本試驗結果還發現，飼糧中添加AMPs-A后仔豬血液T淋巴細胞轉化率顯著高于對照組，這也說明AMPs-A具有減少機體應激、增強機體免疫力的功效。

3.3 抗菌肽與仔豬營養消化利用率的關系

仔豬消化酶活性越高，消化吸收能力越好，添加AMPs能提高十二指腸蛋白酶、淀粉酶活性，從而促進營養物質的消化吸收[11-12]。本試驗結果表明，AMPs-A能提高干物質、鈣、磷、粗蛋白質和粗脂肪消化率，與以上報道基本一致。

3.4 抗菌肽與糞便微生物菌群數的關系

本試驗表明，AMPs-A和AMPs-B能顯著地降低大腸桿菌的數量，同時還能顯著地提高腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌數量，這與Manzanilla等[13]、Namkung等[12]研究結果基本一致。仔豬早期斷奶后受到各種應激導致腸道微生物菌群嚴重失調，斷奶后2 d內回腸中乳酸桿菌的數量幾近消失，而大腸桿菌的數量顯著增加，且pH越高，大腸桿菌的數量越多，而大腸桿菌是引起仔豬斷奶后腹瀉的主要病原菌[14]。Chen等[14]進行了天蠶素的體外抑菌試驗，結果發現，腸道中大量的致病菌，如大腸桿菌和沙門氏菌等被優先抑制。由此可見，抗菌肽具有較強的抑菌效果。

4 結論

（1）在仔豬飼糧中添加AMPs-A有提高仔豬日增重趨勢，有利于提高仔豬的生長性能。

（2）添加AMPs顯著提高血液中IgG含量，AMPs-A顯著提高血液T淋巴細胞轉化率，AMPs顯著提高血清總蛋白水平，使仔豬的免疫機能得到改善。

（3）添加AMPs-A極顯著降低尿素氮水平，顯著提高干物質、粗蛋白質、粗脂肪消化率。

（4）添加AMPs顯著降低腸道大腸桿菌數量，顯著提高乳酸桿菌和雙歧桿菌數量，間接反映了其能夠抑制腸道大腸桿菌的生長和繁殖，增加有益菌數量，維持腸道微生態平衡。

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（編輯：富春妮）

The Research and Application of Plant Extract in Piglets

ZHU Yujing1,WANG Bo1,LI Fangfang1,ZHENG Lili1,GAO Yuan2,MENG Ling2,GUO Fulai2,DING Lan3,ZHANG Yong1
(1.College of Animal Sciences and Veterinary Sciences,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866, China;2.Liaoning Debao Argi-animal Husbandry Co.,Ltd.,Shenyang 110171,China;3.Shen Yang Fukang Agriculture and Animal Husbandry Technology Co.,Ltd.,Shenyang 110164,China)

This test was designed to study the effects of antimicrobial peptides(AMPs)in pig production.180 pigs (10.30±1.13)kg had been randomly divided into 3 groups,and each group 4 repeats,each repeat 15 pigs.The control group was fed based diet,the experimental group were fed basic feeding food with 500 mg/kg AMPs-A and 300 mg/kg AMPs-B.Experiment lasted for 28 days.Results showed that:1)compared with control group,ADG respectively increase 5.66%(P＞0.05),3.92%(P＞0.05),3.85%(P＞0.05)the day of 1～14,15～28,1～28 in AMPs-A. 2)AMPs-A dramatically significantly reduce BUN 14.55%(P＜0.01).3)compared with control group,the IgG of AMPs-A and AMPs-B had increased 2.07%(P＜0.05)and 1.27%(P＜0.05);the TP of AMPs-A and AMPs-B had increased 4.48%(P＜0.05)and 4.03%(P＜0.05);and AMPs-A significantly increased T lymphatic conversion rates 39.02%(P＜0.05)in blood.4)AMPs-A respectively significantly increased DM,CP and EE absorption rate 2.62% (P＜0.05),3.95%(P＜0.05),3.70%(P＜0.05).5)E.coli colony count in pig feces had decreased 5.53%(P＜0.05)and 3.77%(P＜0.05)in AMPs-A and AMPs-B.Lactobacillus in AMPs-A and AMPs-B has increased 4.94%(P＜0.05) and 3.67%(P＜0.05),and Bifidobacterium colony count of AMPs-A and AMPs-B had increased 5.61%(P＜0.05) and 4.75%(P＜0.05).Adding AMPs in daily diet can effectively improve pig growth performance,blood physiological and biochemical indicators feed digestion utilization and improve intestinal microbial balance.The test indicate that adding AMPs-A is better than AMPs-B.

AMPs;weaning pig;production performance;blood physiological and biochemical indices;nutrient digestibility;fecal microflora

S816.7

A

1002-1957(2016)02-0017-04

2015-11-24

國家自然科學基金（31440082和31101253）

朱宇旌（1972-），女，遼寧彰武人，副教授，博士，主要從事動物營養與飼料科學研究工作.E-mail:syndzhyj@163.com

張勇，教授，碩士生導師.E-mail:syndzhy@126.com