抑抗靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)

劉文雅，王　爭(zhēng)，王曙東，湯

（中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京　210002）

抑抗靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)

（中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京210002）

目的 改進(jìn)抑抗靈片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 用薄層色譜（TLC）法定性鑒別制劑中的當(dāng)歸，建立測(cè)定淫羊藿中淫羊藿苷含量的方法。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；含量測(cè)定中，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在3.991 86～63.869 76 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均加樣回收率為98.46%，RSD為1.07%（n=9）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為抑抗靈片的質(zhì)量控制方法。

抑抗靈片；薄層色譜法；高效液相色譜法；淫羊藿苷

抑抗靈片是由淫羊藿、當(dāng)歸、桃仁、枸杞子等10味中藥組方的中藥復(fù)方制劑，為我院制劑科研發(fā)的非標(biāo)制劑，具有益腎生精的功效，用于抗精子抗體陽(yáng)性引起的不育癥。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜（TLC）法對(duì)淫羊藿、枸杞子進(jìn)行定性鑒別，無指標(biāo)性成分的定量檢測(cè)。筆者在原有基礎(chǔ)上，增加了當(dāng)歸的TLC定性鑒別，并建立淫羊藿中淫羊藿苷定量檢測(cè)的高效液相色譜（HPLC）法，旨在為控制其質(zhì)量提供客觀定性定量的評(píng)價(jià)方法，完善制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1　儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀（含1525雙泵系統(tǒng)、2487紫外檢測(cè)器、717自動(dòng)進(jìn)樣器及Empower2色譜工作站，Waters公司）；Mettler Toledo AE240型電子天平，KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2試藥

抑抗靈片（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科自制）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110737-200415，純度為99.3%）；枸杞子對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為121072-200505）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為120927-200613）；硅膠G（供薄層層析用，青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1淫羊藿薄層色譜鑒別［1］

取本品30片，除去包衣，研碎，加乙醇80 mL，加熱回流1 h，濾過，蒸干，殘?jiān)檬兔眩?0～60℃）洗滌3次，每次10 mL，棄去洗滌液，殘?jiān)〖訜釗]去石油醚，加2%氫氧化鈉溶液30 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿對(duì)照藥材1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方量1%的量，稱取除淫羊藿以外的其余藥材，按制劑工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

2.1.2枸杞子薄層色譜鑒別［2］

取本品20片，除去包衣，研碎，加水100 mL，煎煮15min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次10mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方量1%的量，稱取除枸杞子以外的其余藥材，按制劑工藝及供試品溶液制備方法制備陰性品對(duì)照溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，同時(shí)陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

圖1　淫羊藿薄層色譜圖

圖2　枸杞子薄層色譜圖

2.1.3當(dāng)歸薄層色譜鑒別［3-4］

取本品40片，除去包衣，研細(xì)，加乙醚30 mL，浸泡4 h以上，濾過，濾液自然揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材2 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方量1%的量，稱取除當(dāng)歸以外的其余藥材按制劑工藝及供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，同時(shí)陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3　當(dāng)歸薄層色譜圖

2.2淫羊藿苷含量測(cè)定［5-6］

2.2.1色譜條件

色譜柱：Hedera-ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（29∶71）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算大于1 500。

2.2.2溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取淫羊藿苷對(duì)照品8.04 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯萃取4次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例稱取除淫羊藿以外的其余藥材，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按擬訂方法進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處，有相同色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無此峰出現(xiàn)，表明其對(duì)樣品測(cè)定無干擾。結(jié)果見圖4。

圖4　淫羊藿苷高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取淫羊藿苷貯備液0.5，1.5，3.0，5.0，8.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=20 729 966 X+1 201，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在3.991 86～63.869 76 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的 RSD為0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，常溫下分別于0，1，2，4，8 h時(shí)進(jìn)樣，記錄淫羊藿苷峰面積。結(jié)果的 RSD為1.83%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD為1.72%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品（批號(hào)為140519）0.25 g，共 9份，置50 mL錐形瓶中，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品貯備液2.4，3.0，3.6 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液各10 μL注入色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1　淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.4樣品含量測(cè)定

取3批抑抗靈片，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果批號(hào)為140422，140519，140612的樣品中，淫羊藿苷含量分別為0.93，0.88，0.99mg／g。

3　討論

抑抗靈片為我院制劑科研發(fā)的非標(biāo)制劑，具有益腎生精的功效，用于抗精子抗體陽(yáng)性引起的不育癥，臨床應(yīng)用多年，效果顯著。抑抗靈片原標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)淫羊藿、枸杞子進(jìn)行定性鑒別，不符合制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升要求。本試驗(yàn)曾嘗試增加女貞子的定性鑒別，但女貞子的陰性對(duì)照存在干擾，故抑抗靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不再選用女貞子作為研究對(duì)象。當(dāng)歸有補(bǔ)血活血、潤(rùn)腸通便之功效［7］，主治血虛頭昏、面色不華、跌打損傷、瘀血腫痛、血脈瘀滯、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍癰腫、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)、崩漏及產(chǎn)后瘀滯腹痛等病癥。其化學(xué)成分主要分為揮發(fā)油部分和水溶性部分，揮發(fā)油部分為主要成分，包括中性、酸性及酚性油三部分。其中，藁苯內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油部分的主要成分，水溶性成分主要有阿魏酸及多糖等［8］。選擇其有效成分作為觀察指標(biāo)進(jìn)行薄層鑒別，曾采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，經(jīng)試驗(yàn)，斑點(diǎn)顯色不清晰。本試驗(yàn)中采用正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，晾干后置紫外光燈（365 nm）下檢視，薄層色譜結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，所建立的方法較簡(jiǎn)單，陰性無干擾，且分離度和重復(fù)性好。

淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、益精補(bǔ)氣等功效，可用于治療腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、四肢麻木不仁等病癥，為常用的補(bǔ)腎壯陽(yáng)藥物［9］。主要有效成分為黃酮類化合物，還包括酚苷類、多糖類、有機(jī)酸等，代表性成分為淫羊藿苷［10］，具有體內(nèi)、外多種生物活性［11］，可增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、延緩腎衰竭的進(jìn)程、增強(qiáng)雄性生殖功能、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老等［12］。本試驗(yàn)中增加了淫羊藿苷指標(biāo)成分的含量測(cè)定，同時(shí)刪除原標(biāo)準(zhǔn)中“醇浸出物”的含量測(cè)定。分別采用甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇超聲提取30 min，結(jié)果顯示甲醇超聲含量較高，且陰性對(duì)照無干擾，故選定甲醇為提取溶劑。同時(shí)，對(duì)甲醇提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果1 h即可將樣品中淫羊藿苷基本提取完全。但采用甲醇超聲提取，進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)含量較高，淫羊藿苷峰面積相對(duì)其他峰較小，后采用甲醇超聲后乙酸乙酯萃取以除去部分雜質(zhì)，并對(duì)萃取次數(shù)及用量進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，萃取4次和5次含量差異不大，故選擇乙酸乙酯萃取4次，轉(zhuǎn)移率達(dá)98%以上。

綜上所述，該方法具有良好的線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，且回收率高，可對(duì)抑抗靈片中淫羊藿苷的含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。作者簡(jiǎn)介：劉文雅，女，碩士研究生，主管藥師，主要從事中藥新制劑研究，（電話）025-80863161（電子信箱）aya_a＠sina.com；湯，男，碩士研究生，副主任藥師，主要從事中藥新制劑研究，本文通訊作者，（電話）025-80860343（電子信箱）tanghao＠126.com。

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Quality Standard Improvement for Yikangling Tablets

Liu Wenya，Wang Zheng，Wang Shudong，Tang Hao
（Nanjing General Hospital of PLA Nanjing Military Area Command，Nanjing，Jiangsu，China210002）

ObjectiveTo improve the quality standard for Yikangling Tablets.MethodsAngelica sinensis in the Yikangling Tablets was detected qualitatively by TLC.The content of icariin in herba epimedii was determined by HPLC.ResultsThe spots on TLC plates were clear without the interference of negative control.Icariin showed a linear relationship within the concentration range of 3.991 86-63.869 76 μg／mL（r=0.999 9）.The average recovery was 98.46%，and the RSD was 1.07%（n=9）.ConclusionThe method is simple，accurate，sensitive，specific and reproducible.It can be used for the quality control of Yikangling Tablets.

Yikangling Tablets；TLC；HPLC；icariin

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2016）20-0049-04

（2016-06-01）