野生枝瑚菌多糖的提取及單糖組成分析

徐紅霞,蔣媛媛,洪雅雯,應鐵進

(浙江大學食品科學與營養系,浙江杭州 310058)

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野生枝瑚菌多糖的提取及單糖組成分析

徐紅霞,蔣媛媛,洪雅雯,應鐵進*

(浙江大學食品科學與營養系,浙江杭州 310058)

為探索野生枝瑚菌多糖水浸提的最佳條件,在單因素實驗基礎上,采用合理的實驗設計方案,應用響應面分析法優化野生枝瑚菌多糖的提取條件,并采用柱前衍生高效液相色譜法測定野生枝瑚菌多糖的單糖組成。根據回歸分析得到野生枝瑚菌粗多糖的最佳提取條件為溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),時間3.2 h,在此條件下野生枝瑚菌多糖得率為1.97%。高效液相色譜分析結果表明枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。實驗結果表明,響應面法對野生枝瑚菌多糖的提取條件優化合理可行,PMP-HPLC法,可用于測定野生枝瑚菌多糖中單糖的組成。

響應面分析法,野生枝瑚菌多糖,提取工藝,單糖組成

食用菌多糖是食用菌子實體,或菌絲中存在的一類活性多糖,具有廣泛的藥理活性[1]和保健作用。食用菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、調節免疫機能、降血脂等生物活性[2],具有很好的研究與開發價值。

野生枝瑚菌(Ramariasp.)又名掃帚菌,刷把菌,屬于非褶菌目,枝瑚菌科,枝瑚菌屬,是一種常見的真菌科類,子實體中等大小,多分枝形成稠密的細枝,呈珊瑚狀,夏秋季在山區云杉等針葉林中地上的落葉層或枯枝,落果上群生,往往密集在一起,該科各屬含有很多別具風味的食用菌,是我國野生食用菌資源中寶貴的組成部分[3]。據報導部分枝瑚菌對小白鼠肉瘤(S-180)和艾氏癌(EC)有較強抑制作用[4],所以該類真菌很有研究價值。目前國內外對枝瑚菌多糖提取工藝的研究報道較少[5-6],而且未見關于枝瑚菌多糖單糖組成的報道。本研究以采自貴州的野生枝瑚菌為原料,在單因素實驗的基礎上進行響應面優化實驗,以多糖得率為指標研究枝瑚菌多糖的最佳提取工藝,并采用柱前衍生高效液相色譜法測其單糖組成。為今后進一步研究和開發野生枝瑚菌資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生枝瑚菌鮮品購于貴州婷婷野生食用菌批發中心,晾干備用；葡萄糖,無水乙醇,濃硫酸,苯酚,三氯甲烷,正丁醇,三氟乙酸,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),氫氧化鈉,鹽酸 均為分析純；乙腈 色譜純,單糖標品購自sigma公司。

TU-1810紫外-可見分光光度計 普析通用;SHZ-D(Ⅲ)循環水真空泵 杭州明遠儀器有限公司;HH-S電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海福瑪實驗設備有限公司;飛利浦攪拌機 飛利浦家庭電器有限公司;高效液相色譜儀LC-20AD 日本島津。

1.2 提取方法及純化

野生枝瑚菌干品→去雜,洗凈→50 ℃烘干至恒重→熱水浸提→離心抽濾,收集水提液→減壓濃縮→加入三倍體積無水乙醇4 ℃醇沉過夜→離心收集沉淀→低溫烘干得多糖粗提物[7]

將粗提物溶于水,經sevage法除蛋白,AB-8大孔吸附樹脂脫色,透析后冷凍干燥,用于單糖組成分析。

1.3 多糖含量測定

多糖含量的測量方法選用苯酚-硫酸法[8-10]。每組實驗重復3次。

多糖得率(%)=(m/M)×100

注:m-多糖粗提物質量;M-樣品質量。

1.4 單因素實驗

本實驗在水料比20∶1 (mL/g),提取時間2 h,提取一次的前提下,提取溫度分別選60、70、80、90、100 ℃這五個水平進行實驗;在提取溫度為80 ℃,提取時間2 h,提取一次的前提下,水料比分別選10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)這五個水平進行實驗;在提取溫度為80 ℃,水料比20∶1,提取一次的前提下,提取時間分別選1、2、3、4、5 h這五個水平進行實驗;在提取溫度為80 ℃,在水料比20∶1 (mL/g),提取時間2 h的前提下,以上一次提取多糖后的殘渣為原料進行提取,分別計算提取一次、提取兩次、提取三次、提取四次多糖的得率。每組平行三次,計算野生枝瑚菌多糖得率。

1.5 響應面優化實驗

[11-13]的方法,根據單因素實驗結果,通過Design-Expert8.0.6軟件,采用Box-benhnken中心組合實驗設計,采用三因素三水平響應面分析法,以確定最優提取工藝,響應值Y為多糖得率(%)。

因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素水平編碼表Table 1 Experiment factors,level and code

1.6 野生枝瑚菌多糖的單糖組成分析

衍生物的制備[14-15]:稱取5 mg多糖于具塞試管,加2 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA),混勻封管,110 ℃水解4 h。減壓蒸干,再加甲醇3 mL蒸干,重復三次,除盡TFA,加0.5 mL水溶解,離心,取100 μL上清液于離心管,加入100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液,100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉混合均勻,然后70 ℃水浴30 min,取出冷卻,加入100 μL 0.3 mol/L的鹽酸中和,加1 mL水和1 mL氯仿萃取,棄去氯仿層,共萃取3次,上清液過0.45 μm濾膜轉移到進樣瓶備用。

衍生物的液相色譜條件:紫外檢測器 250 nm,流速 1.0 mol/min,柱溫 25 ℃,進樣體積10 μL,運行時間35 min。

流動相A:15%乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH6.9)

流動相B:40%乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH6.9)

梯度模式:時間梯度0→10→25→30 min,對應溶劑B質量濃度梯度0→18%→25%→30%。

對照標準單糖:葡糖糖(Glu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)做同樣處理。

1.7 數據統計分析

運用SPSS16.0對數據進行統計分析,并用Origin8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 提取溫度對多糖得率的影響 由圖1可以看出,在60～90 ℃范圍內,隨著溫度的升高多糖的得率逐漸增加,當溫度超過90 ℃后,多糖的得率開始下降。這主要是由于在高溫作用下,水溶性多糖的結構遭到破壞,造成多糖得率下降。因此適宜的提取溫度為90 ℃左右。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides

2.1.2 水料比對多糖得率的影響 由圖2可知,在一定范圍內,多糖得率隨水料比的升高而逐漸增多,而當水料比超過30∶1 (mL/g)時多糖的得率開始下降,水料比太小物料無法充分溶解導致得率偏低,水量多些有利于多糖的擴散傳質,但水量過多也會增加后續蒸發濃縮時間,從實驗結果可知水料比30∶1 (mL/g)較為合適。

圖2 水料比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratios of water to materials on extraction yield of polysacchariedes

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響 由圖3可知,多糖得率隨時間的延長而增加,到3 h到達最大值隨后開始下降,因此提取時間在3 h左右為宜。時間過短多糖溶解不充分未被充分提取,時間過長又容易引起多糖降解及結構的變化,甚至使其中的五碳環或六碳環裂解而轉變為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖,在醇沉過程中有所損失,最終會導致多糖得率的下降[16]。

圖3 提取時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of polysacchariedes

2.1.4 提取次數對多糖得率的影響 由圖4可以看出提取一次就可以把大部分的多糖提取出來,而且增加提取次數不但耗能而且耗時,從節能省耗、減少操作工序考慮提取一次即可。

圖4 提取次數對多糖得率的影響Fig.4 Effect of the extract times on the yield of polysaccharides

2.2 響應面分析結果

采用Design-Expert軟件,對實驗結果進行回歸分析,實驗方案及結果見表2,分析結果見表3。

表2 響應面實驗安排及結果Table 2 RSM design and polysaccharides yield

注:共有15個實驗,其中1～12為析因實驗,13～15為中心實驗,用以估計誤差。

三個因子經過擬合得到的回歸方程為:Y(%)=1.92+0.041X1+0.054X2+0.069X3-0.034X1X2+1.15×10-3X1X3+2.575×10-3X2X3-0.23X12-0.14X22-0.13X32

將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平,得到另外2個因素的交互影響結果。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.1 溫度和水料比對多糖得率的影響 圖5是溫度和水料比交互作用對多糖得率的影響。由圖可知溫度和水料比兩者的交互作用比較明顯,當溫度不變時,野生枝瑚菌多糖的得率隨著水料比的增大表現為先上升后下降,當水料比不變時,多糖得率隨溫度的升高表現為先上升后下降。從圖中響應面的最高點和等值線可以看出在所選范圍內存在極值,既是響應面的最高點也是等值線最小橢圓的中心點。

圖5 浸提溫度、水料比及其交互作用 對多糖得率的影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface diagram and contour plot of extraction temperature and extraction time on Y

2.2.2 溫度和時間對多糖得率的影響 圖6可以看出當水料比為20∶1(mL/g)時,隨著時間的增加多糖得率也逐漸增大,而后稍有下降,隨著溫度的升高多糖得率先增加后下降,多糖得率的變化速率顯示時間的效應大于溫度。提取溫度過高、時間過長會導致一些大分子多糖降解。

圖6 浸提溫度和時間對多糖得率的影響響應面和等值線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot of extraction temperature and extraction time on Y

2.2.3 水料比和時間對多糖得率的影響 由圖7可以看出,相對于水料比,浸提時間對野生枝瑚菌多糖得率的影響較為顯著,表現為曲線較陡,等高線密集,隨著水料比的增加多糖得率先增加后減小,水料比適宜細胞升溫快,細胞壁能較快破裂,多糖得率高,隨著液料比增加細胞升溫緩慢,破壁效應減小,多糖得率降低。因此提取時間不宜過長水料比不宜過大。

圖7 水料比和時間對多糖得率影響的響應面和等值線圖Fig.7 Response surface diagram and contour plot of water to materials ratio and extraction time on Y

2.2.4 最佳工藝參數的確定 由Design-Expert 8.0.6軟件分析得到最大響應值(Y)時,X1,X2,X3對應的編碼值分別為0.08,0.19,0.27。與其對應的野生枝瑚菌粗多糖的最佳提取條件為提取溫度90.8 ℃,水料比31.9∶1(mL/g),提取時間3.27 h,在此條件下野生枝瑚菌粗多糖得率的理論值為1.9358%,為了檢驗響應面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進行野生枝瑚菌粗多糖提取的驗證實驗。考慮到實際可操作性,將優化參數設置為提取溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),提取時間3.2 h。

采用上述優化參數提取野生枝瑚菌多糖,測得3次驗證實驗結果平均值為1.9663%,與理論值相差0.031%,相差不大。因此響應面法優化得到的野生枝瑚菌粗多糖的提取工藝參數是可行的。

2.3 野生枝瑚菌多糖的單糖組成分析

經柱前衍生化高效液相色譜分析得到野生枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。野生枝瑚菌多糖主要由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成。

圖8 7種單糖標品混合物的高效液相色譜圖Fig.8 The HPLC chromatograms of mixture of seven standard monosaccharide注：1.甘露糖；2.核糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖； 5.半乳糖；6.木糖；7.巖藻糖，圖9同。

圖9 枝瑚菌多糖高效液相色譜圖Fig.9 The HPLC chromatograms of Ramaria mushroom polysaccharide

3 結論

通過單因素實驗設計,以及在單因素實驗基礎上通過三因素三水平響應面法實驗,應用Design-Expert8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design建立野生枝瑚菌多糖提取的數學模型為:Y(%)=1.92+0.041X1+0.054X2+0.069X3-0.034X1X2+1.15×10-3X1X3+2.57510-3X2X3-0.23X12-0.14X22-0.13X32;提取工藝的優化參數為提取溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),提取時間3.2 h。按此條件提取野生枝瑚菌多糖得率為1.97%,與理論值相對誤差僅1.58%,說明建立的模型能很好的預測各因素與多糖得率之間的關系,響應面分析法優化野生枝瑚菌多糖的提取工藝是可行的。

運用高效液相色譜法對野生枝瑚菌多糖的單糖組分進行分析表明,枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。

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Extraction and analysis of monosaccharide compositions of wildRamariasp. polysaccharide

XU Hong-xia,JIANG Yuan-yuan,HONG Ya-wen,YING Tie-jin*

(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

TooptimizetheextractionconditionsforthepolysaccharidesfromRamariasp.,basedonthesinglefactortrials,theresponsesurfacemethodologywereapplied.Usingthehighperformanceliquidchromatographyforthedeterminationofthemonosaccharidecomposition.Theresultsshowedthattheoptimumextractionconditionswasasfollows:temperature91 ℃,water-to-material-ratio32∶1(mL/g),time3.2h.Undertheseconditions,theactualextactionratewas1.97%.ThePMP-HPLCresultsshowedthattheRamariasp.polysaccharideswascomposedofmannose,ribose,glucose,galatose,xylose,andfucoseandtheirmolarratiowasabout45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24.Conclusion:TheRSMmethodcouldbeusedforoptimizingtheextractionconditionofRamariasp.polysaccharidesandthePMP-HPLCmethodcouldbeusedfordeterminationofpolysaccharidecompositions.

surfaceresponsemethodology;wildRamariasp.polysaccharide;extractiontechnique;momosaccharidecomposition

2016-05-30

徐紅霞(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物活性成分，E-mail:hongxiaxu35@163.com。

*通訊作者:應鐵進(1958-)，男，博士，教授，研究方向：農產品采后生理和儲運保鮮，E-mail:tjying@zju.edu.cn。

浙江大學馥莉食品研究院資助項目(KY201405)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0255-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.040