Alcalase對高溝捆蹄肌肉蛋白質水解變化規律研究

張迎陽,強 敏,章建浩

(1.常州大學食品學院,江蘇常州 213164;2.鎮江市產品質量監督檢驗中心,江蘇鎮江 212132;3.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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Alcalase對高溝捆蹄肌肉蛋白質水解變化規律研究

張迎陽1,強 敏2,章建浩3,*

(1.常州大學食品學院,江蘇常州 213164;2.鎮江市產品質量監督檢驗中心,江蘇鎮江 212132;3.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

以豬后蹄肉為原料,在腌制過程添加Alcalase作為酶解劑,并通過響應曲面實驗法優化酶解工藝;通過SDS-PAGE電泳分析及游離氨基酸組分分析Alcalase對捆蹄蛋白質的酶解作用規律。結果表明,Alcalase在腌制溫度為4～16 ℃時,對促進高溝捆蹄蛋白質水解及提高其感官品質有顯著的促進的作用(p<0.05),過量的Alcalase(大于1.6 U/g)會導致蛋白質過度水解,不利于產品的感官品質。響應曲面法優化捆蹄加工工藝結果為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,產品蛋白質水解指數為14.81%,感官評分92.47。另外,添加Alcalase蛋白酶后,捆蹄中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku處,蛋白質條帶逐漸累積;Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有顯著的增加,而Pro、Glu含量顯著降低(p<0.05)。因此,Alcalase能顯著促進捆蹄中蛋白質的分解,提高產品的感官品質,可以應用于捆蹄產業的生產加工。

捆蹄,Alcalase酶解,工藝優化,蛋白質水解

高溝捆蹄是江蘇省淮安市著名特產,歷史悠久且加工過程精細,在全國范圍內享譽盛名[1-2];其加工原料為豬蹄髈肉及其他調味料,具有原料廉價、食用方便的特點,深受消費者的喜歡[3-4]。但是隨著消費者生活水平的提高,在豐富產品風味品質及營養成分的同時,消費市場對捆蹄的食用品質也提出了更高的要求[5]。主要是因為捆蹄中含有較多的肌纖維蛋白質及膠原蛋白質,影響了產品的嫩度,影響了現代消費者對產品的食用品質[6]。因此,提高捆蹄的食用品質,以適應現代消費理念,對促進高溝捆蹄的發展具有重要的推動作用。研究表明,在捆蹄腌制過程中添加的天然香辛料等對肉制品的嫩度改善作用較小[7-8];因此,本研究以酶解作用專一性較弱的Alcalase作為外源蛋白酶,利用其酶解作用專一性較弱的特點改善捆蹄的食用品質。研究報道,Alcalase酶切作用位點主要為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp[9-10],并且酶解條件溫和、產物安全性高、營養價值高、易消化、易與其他風味物質搭配,是改造蛋白質,提高蛋白質價值的最有效途徑之一,在風雞及肉的副產品加工領域中已有廣泛的應用[11-13],但是在捆蹄等豬肉產品中的研究中還未見報道。本研究通過在腌制過程中添加Alcalase作為酶解腌制劑,通過響應曲面實驗法優化捆蹄酶解加工工藝,并且通過捆蹄產品的蛋白質分解及游離氨基酸釋放規律驗證該工藝的可行性,以期為捆蹄產業的開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬后蹄肉 同批豬肉,豬齡11個月,購自淮安蘇食肉品有限公司;食鹽、香辛料及調味料均為高溝市售;堿性蛋白酶(Alcalase)2.4L(酶活力>200×104U/g) 丹麥諾維信公司;考馬斯亮藍、過硫酸胺、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、溴酚藍、巰基乙醇均為Sigma試劑公司;消化片(5.5 g硫酸鉀和0.5 g無水硫酸銅)、三氯乙酸(TCA)、硫酸(H2SO4)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、鹽酸等常規化學試劑均為國藥集團分析純級。

HH-W420數顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;TM自動凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司;FR-980生物電泳圖象分析系統 上海復日科技有限公司;Beckman Allegra 64R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;2300型Kjeltec 101-O-S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠;602S穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠;JA2203N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;氨基酸自動分析儀 日本日立公司;SPX-250C型恒溫恒濕箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 捆蹄加工工藝 原料肉→清洗切碎→修整→腌制→捆扎→蒸煮→冷卻包裝

工藝加工點:腌制,將配制好的香辛料及調味料等與碎肉混勻,在所需的溫度條件下腌制;捆扎,將腌制好的原料肉用腸衣包裹,用長約蒸煮消毒過的麥草繩將包裹好的捆蹄先扎緊(間距約2 cm),成圓形蹄髈形狀(直徑約4 cm)。

1.2.2 單因素實驗 腌制溫度:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為1.2 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),分別在腌制溫度為0、4、8、12、16、20 ℃條件下,腌制20 h,分析產品蛋白質的分解情況及感官評價結果。對照組:未添加Alcalase。

Alcalase添加量:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),在12 ℃條件下腌制20 h,分析產品蛋白質的分解情況及感官評價結果。

腌制時間:在捆蹄腌制階段固定Alcalase添加量為1.2 U/g(酶溶液為10 U/g的磷酸緩沖液),在腌制溫度為12 ℃條件下分別腌制16、18、20、22、24、26 h,分析產品蛋白質的分解情況及感官評價結果。對照組:未添加Alcalase。

1.2.3 響應面法實驗設計 在Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白質的單因素實驗結果基礎上,以Alcalase添加量、腌制溫度及腌制時間為因素(以X1、X2、X3表示),具體取值范圍見表1;以產品的蛋白質水解指數及感官評分值為響應值采用design-expert8.0.6設計響應曲面實驗。

表1 因素水平表Table 1 Levels and factors of test

1.2.4 蛋白質水解指數測定 蛋白質水解指數測定按照如下方法[14]:

總氮(TN)測定:將解凍的樣品剔除可見脂肪、肌內膜和肌間膜并絞碎,稱取1.000 g上述樣品以及1塊消化片和12 mL濃硫酸于消化管中,消化1.5 h(420 ℃),用凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

非蛋白氮(NPN)含量測定:將解凍的樣品剔除可見脂肪、肌內膜和肌間膜并絞碎,稱取5.000 g上述樣品于離心管中,并加入25 mL的10% TCA(m/V)溶液混勻,10000 r/min下分三次高速勻漿20 s,4 ℃下放置過夜后5000 g冷凍離心5 min,過濾取濾液于消化管中,用5 mL硫酸于220 ℃下烘干水分,再將7 mL硫酸加入消化管中于420 ℃下消化1.5 h,用凱氏定氮儀測定樣品中氮的含量。

蛋白質水解指數(P.I.%)=NPN/TN%

1.2.5 游離氨基酸組成測定 參照Virgil的方法測定[15]:準確稱取樣品6.00 g,加入60 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5),勻漿(6000 r/min,3 min),離心(10000×g,4 ℃,20 min),定容至100 mL,取上清液5 mL,用3%水楊酸溶液調節pH至2.0,離心(15000×g,4 ℃,20 min),用雙蒸水定容至10 mL,取溶液0.5 mL,使用0.02 mol/L鹽酸稀釋5倍,用氨基酸自動分析儀檢測。檢測條件:洗脫液為檸檬酸緩沖液(pH3.3～4.9),顯色液為茚三酮∶乙二醇甲醚∶乙酸鈉緩沖液=2.75∶25∶1,除羥脯氨酸在440 nm檢測外,其余氨基酸均在570 nm檢測。

表2 感官評價指標及標準Table 2 Evaluation and standards of sensory evaluation

1.2.6 SDS-PAGE電泳分析 SDS-PAGE實驗方法[16-17]:將酶解后的蛋白產物配制成蛋白樣品并與標準分子量蛋白進行SDS-PAGE,分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%,用考馬斯亮藍G-250染色,Quantity-One分析蛋白質分子量。

1.2.7 感官評定方法 分別請具有捆蹄生產經驗的技術人員10人參加產品的感官評定,產品的感官評價方法采用趙接紅[1]對淮陽捆蹄的感官評定方法,分別從顏色、氣味、滋味、質地四個方面分析。具體指標見表2(n=3)。

1.2.8 數據統計分析 用Microsoft Excel進行數據整理及作圖分析。不同平均值之間用SAS 9.2(SAS Institute Inc,Cary,North Carolina,USA)統計軟件的GLM程序(General Linear Model procedure)中的鄧肯氏多重比較法(Duncan’s Multiple Range Test)進行差異顯著性檢驗(n=3)。

2 結果與分析

2.1 Alcalase酶解捆蹄肌肉蛋白質過程的單因素分析

肉制品中蛋白質水解指數是非蛋白氮與蛋白氮的比值,是衡量肉制品品質的重要指標;研究表明,在肌肉中蛋白質水解指數超過15.0%時會明顯增加其嫩度,但可能會出現變粘、不成形等不良現象[2,18],因此調控捆蹄中蛋白質的水解程度也是提高產品品質的重要因素。圖1為腌制溫度對捆蹄品質的影響。隨著腌制溫度的升高,捆蹄的蛋白質水解指數呈顯著的升高趨勢(p<0.05),并且在腌制溫度大于8 ℃后,實驗組蛋白質水解指數顯著高于對照組(p<0.05);因此可以看出,Alcalase對捆蹄蛋白質水解有促進作用;當腌制溫度為20 ℃時,該指標為16.35%±0.18%。對應產品的感官品質可以看出,伴隨著蛋白質水解程度的增加,在一定腌制溫度范圍內(4～16 ℃),實驗組感官評分顯著高于對照組。因此,在一定腌制溫度范圍內(4～16 ℃),Alcalase可顯著提高捆蹄產品的感官品質(p<0.05)。

圖1 不同腌制溫度對捆蹄蛋白質 水解指數及感官品質的影響Fig.1 Effect of temperature on PI and sensory evaluation of bundle hoof

由圖2可以看出,隨著Alcalase添加量的增加,捆蹄蛋白質水解指數呈顯著的增加趨勢(p<0.05),并且在添加量大于1.2 U/g后,蛋白質水解指數急劇增加,對應的產品的感官品質隨著Alcalase添加量的增加呈顯著的增加(p<0.05)。但是,當酶添加量大于1.6 U/g后,感官品質顯著降低(p<0.05)。主要是因為過量的Alcalase導致捆蹄蛋白質過度水解,從而降低了產品的感官品質[14]。

圖2 Alcalase添加量對捆蹄蛋白質 水解指數及感官品質的影響Fig.2 Effect of Alcalase dosage on PI and sensory evaluation of bundle hoof

表3 響應曲面實驗結果Table 3 Results of response surface

注:同列中不同字母(a.b.c…)表示差異顯著(p<0.05)。由圖3可以看出,隨著腌制時間的延長,捆蹄的蛋白質水解指數呈顯著的增加趨勢,并且實驗組顯著高于對照組(p<0.05);在腌制26 d時,實驗組蛋白質水解指數為15.56%±0.19%;而對于產品的感官品質,對照組在腌制過程中呈顯著的增加趨勢;但是對于實驗組,在腌制22 d后出現顯著的下降趨勢(p<0.05),可能是因為隨著腌制時間的延長,Alcalase導致蛋白質過度水解,從而影響了產品的風味品質[14]。

圖3 不同腌制時間對捆蹄蛋白質 水解指數及感官品質的影響Fig.3 Effect of time on PI and sensory evaluation of bundle hoof

綜合上述分析可以看出,在捆蹄的腌制過程中,外源蛋白酶Alcalase能顯著的促進捆蹄蛋白質水解的進程,并且與腌制條件呈顯著的相關性。進一步優化腌制工藝對捆蹄生產加工有重要的意義。

2.2 高溝捆蹄腌制工藝優化

2.2.1 響應曲面實驗結果 從響應曲面實驗結果可以看出,部分處理組能顯著提高蛋白質水解指數,并且對捆蹄的感官評分有顯著的促進作用。

2.2.2 響應面實驗結果分析

2.2.2.1 回歸模型建立及顯著性分析 對表3中的數據分別以PI(Y1)及感官評分(Y2)為響應值,以Alcalase添加量(X1)、腌制溫度(X2)、腌制時間(X3)為自變量建立二次回歸模型如式(1)、式(2)。為了進一步分析回歸模型的顯著性及變量因素對響應值的影響程度,對模型系數進行檢驗結果見表4。

Y1=15.040+1.883X1-0.432X2-0.711X3+0.180X1X2+0.213X1X3+0.083X2X3-2.624X12-0.044X22-5.766×10-3X32

式(1)

Y2=-93.511+40.946X1+3.935X2+12.310X3+0.143X1X2-0.057X1X3+0.027X2X3-15.840X12-0.166X22-0.296X32

式(2)

表4 回歸模型系數顯著性檢驗Table 4 Test for significance of regression coefficients

注:p<0.01水平極顯著,用**表示,p<0.05水平顯著,用*號表示。

表5 不同處理捆蹄中游離氨基酸含量分析Table 5 Analysis of hydrophobic amino acids in bundle hoof

注:同行中不同字母(a.b)表示差異顯著(p<0.05)。2.2.2.2 模型的交互作用分析 腌制溫度與腌制時間對PI的交互作用分析:在固定Alcalase添加量為1.2 U/g時,腌制溫度及腌制時間對捆蹄蛋白質水解指數影響的交互作用結果見圖4。從圖中可以看出,在腌制溫度為12～18 ℃時,腌制時間存在臨界值約為20～22 ℃;并且從圖中可以看出,隨著腌制溫度的升高,影響捆蹄蛋白質水解指數的腌制時間的臨界值呈顯著的降低趨勢。

圖4 腌制溫度和腌制時間 對蛋白質水解指數的交互作用影響Fig.4 Interactive effect between temperature and time on PI

2.2.2.3 工藝優化 綜合上述分析,利用design-expert8.0.6自帶的回歸分析程序對實驗中建立的回歸模型進行優化分析,在固定蛋白質水解指數為13%～15%時,以感官評分的最大值為優化目標,得到捆蹄腌制優化工藝為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,得到PI為14.81,感官評分92.47。以該工藝腌制捆蹄進行驗證實驗得到,PI為14.73%±0.21%,感官評分為93.11±0.86,相對誤差小于5%。因此該工藝可以用于捆蹄的生產加工。

2.3 捆蹄肌肉蛋白質Alcalase酶解規律分析

2.3.1 SDS-PAGE電泳分析 研究表明,Alcalase對蛋白質的酶解作用主要集中于大于72 ku的分子條帶,并且小于30 ku的分子條帶逐漸累積[19]。通過SDS-PAGE電泳分析后可以看出,相比于對照組,實驗組中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,表現為該處蛋白條帶逐漸變暗;另外,在30～40 ku及50～70 ku處,也存在蛋白質逐漸變暗。因此進一步證明,Alcalase對促進捆蹄蛋白質分解有明顯的促進作用。

圖5 捆蹄蛋白質SDS-PAGE電泳結果Fig.5 Result of SDS-PAGE electrophoresis of bundle hoof proteins注:a為實驗組;b為對照組。

2.3.2 游離氨基酸釋放規律研究 Alcalase是一種專一性較弱的蛋白酶,能夠對蛋白質深度酶解,并且在肌肉蛋白質酶解中,Alcalase作用位點主要集中于Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp,可顯著增加肌肉中游離氨基酸含量[10,20]。從表5可以看出,實驗組捆蹄中游離氨基酸總量顯著高于對照組(p<0.05),并且Ala、Leu、Val、Tyr、Phe均有顯著的增加(p<0.05),進一步證明了Alcalase嫩化捆蹄肌肉成分的作用。但是對捆蹄中游離氨基酸的結果可以看出,與對照組相比,除了Ala、Leu、Val、Tyr、Phe外,Ile、Gly、His也有顯著的增加。另外,在實驗組中,Pro、Glu含量顯著低于對照組(p<0.05),可能是因為在腌制過程中轉變為其他風味成分。

3 結論

Alcalase在腌制溫度為4～16 ℃時,對促進高溝捆蹄蛋白質水解及提高其感官品質有顯著的促進的作用(p<0.05),并且過量的Alcalase(大于1.6 U/g)會導致蛋白質過度水解,從而降低了產品的感官品質;腌制溫度及腌制時間對捆蹄蛋白質水解指數有顯著的交互作用,表現為隨著腌制溫度的升高,影響捆蹄蛋白質水解指數的腌制時間的臨界值呈顯著的降低趨勢。響應曲面法優化捆蹄加工工藝為:Alcalase添加量1.32 U/g、腌制溫度14.2 ℃、腌制時間21.3 d,得到PI為14.81%,感官評分92.47。SDS-PAGE電泳分析后可以看出,實驗組中高分子蛋白(≥120 ku)有明顯的分解作用,并且在30～40 ku及50～70 ku處,也存在蛋白質條帶逐漸變暗。腌制結束后,Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Ile、Gly、His有顯著的增加,而Pro、Glu含量顯著降低(p<0.05)。

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Study on muscle protein hydrolysis by Alcalase and optimization pickled process of Gaogou bundle hoof

ZHAGN Ying-yang1,QIANG Min2,ZHANG Jian-hao3,*

(1.College of Food Science,Changzhou University,Changzhou 213164,China;2.Zhenjiang product quality supervision and inspection center,Zhenjiang 212132,China;3.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Inthisstudy,hindhoofmeatwasusedtoproducebundlehoofwithAlcalaseascuringagentandtheprocesswasoptimizedbyresponsesurfacemethod.EnzymatichydrolysisofAlcalaseonbundlehoofproteinwasanalyzedbythemethodofSDS-PAGEelectrophoresisandfreeaminoacidsreleased.TheresultshowedthatAlcalasecouldpromoteproteolysisandimprovethesensoryqualityofbundlehoofwithpickledtemperatureat4～16 ℃.BundlehoofproteincouldbeexcessivehydrolysisandhadbadsensoryqualitywiththeAlcalasedosagehigherthan1.6U/g.TheresultofbundlehoofprocessingoptimizedbytestofresponsesurfacewasAlcalasedosagewas1.32U/gandpickledtemperaturewas14.2 ℃andpickledtimewas21.3d,thenPIwas14.81%andsensoryevaluationwas92.47.SDS-PAGEelectrophoresisshowedproteinhandswithhigherthan120,30～40kuand50～70kuweredecompositionsignificantly,thenAla,Leu,Val,Tyr,Phe,Ile,Gly,HiswassignificantincreasedandPro,Glu(p<0.05)wasdecreasedsignificantly.ItwascouldbeconcludethatAlcalasecouldsignificantlypromotethedecompositionofbundlehoofproteinandimprovethesensoryqualityoftheproduct.SotheAlcalasecouldbeappliedtobundlehoofproduction.

bundlehoof;Alcalase;processoptimization;proteolysis

2016-06-06

張迎陽(1980-)，男，博士研究生，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail:callfull@163.com。

*通訊作者:章建浩(1961-)，男，博士，教授，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail:nau_zjh@njau.edu.cn。

淮安市科技計劃項目(HAN2014030)；國家公益性行業(農業)科研專項(201303082-2)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)21-0249-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.039