云南白牛肝菌酶解工藝優化

劉 佳,王桂瑛,程志斌,谷大海,范江平,王雪峰,葛長榮,廖國周,*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心,云南昆明 650201)

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云南白牛肝菌酶解工藝優化

劉 佳1,2,王桂瑛1,2,程志斌2,谷大海1,2,范江平1,2,王雪峰1,2,葛長榮2,廖國周1,2,*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心,云南昆明 650201)

為白牛肝菌高值化利用與開發提供科學依據。以云南白牛肝菌邊角料為原材,以水解度和感官評分為指標,在單因素實驗基礎上采用正交實驗優化制備鮮味物質的酶解工藝條件。結果表明:風味蛋白酶復合木瓜蛋白酶的最佳酶解條件是酶添加量均為0.3%,料水比為1∶7(g/mL),初始pH為6.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為4 h。采用最佳酶解條件酶解白牛肝菌邊角料,所得酶解液蛋白質水解度為20.16%,感官評分為30.56分。云南白牛肝菌邊角料在風味蛋白酶和木瓜蛋白酶最適條件下酶解效果最佳,所得酶解液香氣濃郁,風味獨特,可用來生產高質量風味調料,同時提高副產品利用率。

白牛肝菌,邊角料,水解度,感官評價

云南獨特地理氣候條件造就野生食用菌品種多樣、產量高、分布廣、聞名海內外。牛肝菌屬資源豐富,風味獨特,營養價值高,是我國珍稀食材之一,常見黑牛肝菌(銅色牛肝菌)、黃牛肝菌(黃皮疣柄牛肝菌、黃癩頭)、白牛肝菌(美味牛肝菌)、小美牛肝菌(見手青)[1]。其中,白牛肝菌最著名,分布在云南、四川、福建等地,桂明英[2]等對白牛肝菌氨基酸含量測定,氨基酸種類齊全,含量豐富。呈味氨基酸、核苷酸與揮發性的酮、醇、酚、酯等化合物一起構成白牛肝菌獨特鮮香風味,極具開發潛力[3]。

然而,多年來云南省受精深加工技術水平限制,野生食用菌產品形式單一,主要以鮮品、干品、速凍、鹽漬品為市場主要銷售產品,缺乏精深加工制品,導致出口創匯能力低,產品附加值低,同時每年在收購、加工過程中有大量菇柄、殘次品和碎屑被廢棄,按10%的廢棄率計算,每年將廢棄3000多噸,不但增加環境污染,而且大量原料資源無法消化[4-5]。如何對這部分資源進行高值化利用是目前創新研究焦點[6]。國內外已經對多個品種的食用菌子實體有研究,但對白牛肝菌加工邊角料開發風味調料的研究報道極少[7]。充分利用白牛肝菌邊角料開發新產品是可持續發展的綠色環境友好型舉動,不僅產品附加值、出口創匯能力能得到提高,白牛肝菌的應用領域能得到擴寬,而且能減少資源浪費與造成的環境污染。本研究以白牛肝菌邊角料為原料,篩選高效復合酶,研究復合酶對白牛肝菌蛋白的最佳酶解條件,為后期生產風味獨特、綠色營養的高品質調味料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白牛肝菌邊角料 云南玉溪市易門康源菌業有限公司,真空包裝后置于-20 ℃冰箱備用,使用前解凍;木瓜蛋白酶(80萬U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g)、中性蛋白酶(10萬U/g)、堿性蛋白酶(10萬U/g)、風味蛋白酶(10萬U/g) 均購自江蘇銳陽生物科技有限公司;其他試劑 國產分析純。

MJ-BL25c4組織搗碎機 廣東美的精品電器制造有限公司;101型電熱鼓風干燥箱 北京中興偉業儀器有限公司;JJ-1精密增力攪拌器 常州澳華儀器有限公司;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-16C高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;KDN-04B半自動凱氏定氮儀 浙江托普儀器有限公司;日立L8800全自動氨基酸分析儀 天美科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要營養成分測定方法

1.2.1.1 水分測定 按 GB5009.3 測定[8]。

1.2.1.2 粗蛋白測定 按GB5009.5 測定[9]。

1.2.1.3 氨基酸測定 按GB/T 5009.124-2003測定[10]。所有樣品分析為5個重復,結果以平均值計。

1.2.2 白牛肝菌酶解工藝

1.2.2.1 酶解工藝 稱取一定質量的白牛肝菌邊角料,洗凈,按一定料水比打漿,倒入適當容器內放入電熱恒溫水浴鍋中,在一定溫度下先恒溫水浴15 min,調至一定初始pH,加入一定種類,一定量的蛋白酶水解,勻速攪拌,酶解一定時間后沸水浴滅酶10 min,滅酶后待料液降至常溫25 ℃,5000 r/min離心10 min,取上清液。

1.2.2.2 甲醛滴定法測定氨基態氮 參考文獻[11],運用公式DH(%)=(游離氨基態氮/總氮)×100[8]求得水解度(degree of hydrolysis,DH),水解度越高,反映蛋白酶解效果越好,釋放出游離氨基酸越多。

1.2.2.3 感官評價(sensory evaluation,SE) 請10名(5男5女)專訓過的感官評價員對酶解液從色澤、氣味、滋味、體態四方面感官評定,與白牛肝菌原料風味的接近程度進行比較評分,每項10分,共40分,接近程度最大的10分,接近程度較大的8分,接近程度一般的6分,接近程度較小的4分,接近程度最小的2分,完全不接近的0分,四項總分為綜合感官評分,以接近程度最大的酶解液為佳[12]。

對酶解上清液水解度測定和感官評價均為5個重復,結果以平均值計。同時做空白實驗。

1.2.3 單一酶篩選 根據木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶特性和大量預實驗結果確定酶解基本條件,見表1,選擇相對于白牛肝菌邊角料底物(以白牛肝菌邊角料干重計,下文同)的六個加酶量水平,即0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。考察不同酶、不同添加量對酶解效果的影響,評價指標為水解度和感官評分。

表1 單一酶酶解工藝設計Table 1 The process design on enzymatic hydrolysis of a single enzyme

注:P1-木瓜蛋白水解酶;P2-菠蘿蛋白酶;N-中性蛋白酶;A-堿性蛋白酶;F-風味蛋白酶,表2同，圖6～圖8同。

1.2.4 雙酶篩選 根據1.2.3所得結果,將風味蛋白酶分別復合木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶進行雙酶篩選實驗,在單酶篩選基礎上確定復合酶解基本條件為見表2,固定風味蛋酶添加量為0.3%,選擇另一種酶的五個加酶量水平,即0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,考察各雙酶組合及不同添加量對酶解效果的影響,評價指標為水解度和感官評分。

表2 雙酶酶解工藝設計Table 2 The process design on enzymatic hydrolysis of two enzymes

1.2.5 復合酶單因素實驗 根據1.2.4所得結果,固定風味蛋白酶和木瓜蛋白酶的添加量均為0.3%,考察料水比、酶解溫度、酶解時間和初始pH對復合酶酶解效果影響,評價指標為水解度和感官評分。

1.2.5.1 料水比的選擇實驗 固定溫度50 ℃,初始pH6.5,酶解時間4 h,研究不同料水比(1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10 (g/mL)對酶解效果影響。

1.2.5.2 酶解溫度的選擇實驗 根據1.2.5.1所得結果,固定料水比1∶7(g/mL),初始pH6.5,酶解時間4 h,研究不同溫度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)對酶解效果影響。

1.2.5.3 酶解時間的選擇實驗 根據1.2.5.1、1.2.5.2所得結果,固定料水比1∶7(g/mL),溫度45 ℃,初始pH為6.5,研究時間(1、2、3、4、5、6 h)對酶解效果影響。

1.2.5.4 酶解初始pH的選擇實驗 根據1.2.5.1、1.2.5.2、1.2.5.3所得結果,固定料水比1∶7(g/mL),溫度45 ℃,酶解時間4 h,研究不同初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對酶解效果影響。

1.2.6 正交設計實驗 以1.2.5復合酶單因素實驗中影響最顯著因素進行正交實驗,研究酶解效果達最佳的酶解條件。用L9(34)正交實驗設計因素水平,見表3。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal test

1.2.7 數據處理 所有數據均以“平均數±標準差”表示。實驗數據處理由Excel完成,作圖由Origin75完成,正交實驗設計由正交設計助手完成,方差分析由spss19.0完成。

2 結果與討論

2.1 白牛肝菌邊角料主要營養成分

白牛肝菌邊角料水分含量為88.73%,粗蛋白含量為35.4%,全氨基酸含量為20.78%。水分是直接影響食用菌鮮嫩的因素之一,何培新[1]測得食用牛肝菌含水量86.8%,桂明英[2]測得美味牛肝菌鮮品含水量86.4%～87.9%,與本實驗白牛肝菌邊角料含水分相差不大,說明白牛肝菌水分含量充足,鮮嫩可口。李燕平[13]測得巴山白牛肝菌粗蛋白含量31.81%,比本實驗中白牛肝菌邊角料粗蛋白含量低3.79%。段玉云[14]測得牛肝菌全氨基酸含量24.60%,比本實驗中白牛肝菌邊角料全氨基酸含量高3.82%。說明白牛肝菌蛋白含量高,氨基酸含量豐富。

2.2 蛋白酶種類選擇

2.2.1 木瓜蛋白酶較適添加量的確定 由圖1知,木瓜蛋白酶添加量從0.1%～0.3%時,水解度、感官評分均不斷增大,在0.3%、0.4%、0.5%時水解度相差甚微,在0.4%時水解度達最大,在0.3%時感官評分達最大,說明當酶量為0.3%時,底物幾乎酶解完全。當酶添加量從0.3%增加到0.5%,水解度不再增加且略有下降,此結果與程玉[12]對海鮮菇酶解條件研究中酶添加量對水解度的影響類似,原因是底物或酶解產物對酶活有抑制。綜上及結合經濟效益分析,確定其較適添加量為0.3%,此時水解度17.97%,感官評分27.04分。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對水解度和感官評分的影響Fig.1 Effect of addition content of Papaya protease on DH and SE

2.2.2 菠蘿蛋白酶較適添加量的確定 由圖2知,隨菠蘿蛋白酶添加量從0.1%～0.3%時,水解度、感官評分均不斷增加,在0.4%時,水解度達最大,在0.3%、0.4%、0.5%時感官評分相差甚微,其中在0.5%時感官評分達最高;在0.4%、0.5%時,水解度與感官評分相差不大,綜上分析,確定其較適添加量為0.4%,此時水解度17.32%,感官評分22.96分。

圖2 菠蘿蛋白酶添加量對水解度和感官評分的影響Fig.2 Effect of addition content of Pineapple protease on DH and SE

2.2.3 中性蛋白酶較適添加量的確定 由圖3知,隨中性蛋白酶添加量增加,水解度、感官評分均不斷增大,但水解度增大趨勢不明顯,當酶加量為0.3%時,水解度達到最大值,感官評分也達到最大值,在0.4%和0.5%時,水解度與酶加量為0.3%時相差不大。綜上及結合經濟效益分析,確定其較適添加量為0.3%,此時水解度14.10%,感官評分25.44分。

圖3 中性蛋白酶添加量對水解度和感官評分的影響Fig.3 Effect of addition content of Neutral protease on DH and SE

2.2.4 堿性蛋白酶較適添加量的確定 由圖4知,水解度隨堿性蛋白酶添加量增加而減小,當酶加量為0.1%時水解度最大,在0.2%時水解度大幅減小,在0.2%～0.5%時水解度減小趨勢平緩。隨酶量增加感官評分卻降低,不加酶時,感官評分最高,表明堿性蛋白酶作用于底物后在感官方面難以接受。綜上分析,確定其較適添加量為0.1%,此時水解度13.06%,感官評分19.04分。

圖4 堿性蛋白酶添加量對水解度和感官評分的影響Fig.4 Effect of addition content of Alkali protease on DH and SE

2.2.5 風味蛋白酶較適添加量的確定 由圖5可知,隨風味蛋白酶添加量的增加,水解度、感官評分也增加。當酶加量為0.3%時,水解度達到最大值,此時感官評分也較好;當酶加量為0.4%、0.5%時,水解度與酶加量為0.3%時相差不大,感官評價較0.3%時稍高。綜上分析,確定較適添加量為0.3%,此時水解度14.75%,感官評分23.28分。

圖5 風味蛋白酶添加量對水解度和感官評分的影響Fig.5 Effect of addition content of Flavourzyme on DH and SE

2.2.6 五種單一酶對酶解實驗效果的影響比較 綜合2.2.1～2.2.5的結果分析可知,各單一酶在較適酶解條件下對水解度和感官評分的影響,見圖6,木瓜蛋白酶水解度和感官評分均最高,分別為17.92%,27.04分。堿性蛋白酶水解度和感官評分均最低,分別為13.06%,19.04分。根據蛋白酶特性和大量預實驗結果可知,風味蛋白酶能讓白牛肝菌邊角料酶解液具有獨特食用菌鮮香,降低蛋白酶解液苦味。復合酶水解既能提高蛋白水解度,減輕苦味,提高速率。雙酶復合分為同加和單酶分步加,但雙酶同加有操作簡便,速率更快等優點[12,15],所以雙酶復合原則:一是與風味酶復合。二是復合后水解度達到最大的兩種酶,高水解度不僅可以降低水解液苦味,同時釋放更多呈味游離氨基酸。本實驗中除風味蛋白酶外,其他四種酶均使酶解液有較高水解度,但考慮堿性蛋白酶調節初始pH操作繁瑣,所得酶解液風味較差,故棄選堿性蛋白酶,而用風味蛋白酶與其他三種分別進行組合完成后續實驗。

圖6 單一酶較適條件下對水解度和感官評分的影響Fig.6 Effect of a single enzyme on DH and SE under nearly favourrable conditions

2.2.7 最佳復合酶的確定 由圖7知,隨酶加量增加,風味蛋白酶與木瓜蛋白酶組合的水解度不斷增加,水解度最高達18.17%,且總高于風味蛋白酶與菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶組合;由圖8知,隨酶加量增加,風味蛋白酶與木瓜蛋白酶組合的感官評分不斷增加,感官評分最高達27.12分,且總高于風味酶與菠蘿蛋白酶,中性蛋白酶組合。因此選擇風味蛋白酶與木瓜蛋白酶組合酶解白牛肝菌邊角料制備酶解液,為后續增香熱反應奠定基礎。

圖7 雙酶添加量對水解度的影響Fig.7 Effect of addition content of two enzymes on hydrolytic rate of protein efficiency

圖8 風味蛋白酶添加量對感官評分的影響 Fig.8 Effect of addition content of two enzymes on sensory evaluation efficiency

2.3 復合酶單因素實驗

2.3.1 不同料水比對白牛肝菌邊角料酶解效果的影響 由圖9知,料水比從1∶4至1∶7時,水解度增加,何培新[7]對美味牛肝菌下腳料抽提物最佳提取工藝里說明,底物濃度降低,底物與起催化反應的蛋白酶充分接觸,更多的酶切位點被催化使蛋白質水解為多肽,進而水解為游離氨基酸;超過1∶7后隨著溶液體積的增加,底物濃度繼續降低使底物與酶接觸機會減少,水解度呈下降趨勢。料水比對色澤、氣味、滋味、體態均有明顯影響,料水比在1∶7 (g/mL)時水解度及感官評分達最大,此時水解度19.94%,感官評分28.72分,故較適料水比為1∶7 (g/mL)。

圖9 不同料水比對水解度和感官評分的影響Fig.9 Effect of ratios of water on DH and SE efficiency

2.3.2 不同酶解溫度對酶解效果的影響 由圖10知:當溫度由35 ℃升到45 ℃時,水解度,感官評分逐漸增大,水解度在45 ℃時達到最大;當溫度由45 ℃升高到65 ℃時,水解度逐漸降低,感官評分先保持穩定后逐漸降低。李霞[17]在對香菇風味物質酶解提取工藝中提到,溫度影響酶活性,當適宜溫度時升溫可以讓酶促反應速率加快,但溫度過高可導致酶失活,酶反應逐漸降低致水解度出現下降。綜上分析,確定較適溫度為45 ℃。

圖10 酶解溫度對水解度和感官評分的影響Fig.10 Effect of hydrolysis temperature on DH and SE efficiency

2.3.3 不同酶解時間對酶解效果的影響 由圖11知:當酶解時間由1 h增至4 h時,水解度,感官評分明顯增大;當酶解時間由4 h增加到6 h時,水解度逐漸趨于平緩,感官評分降低,李霞[17]在對香菇風味物質酶解提取工藝中提到,隨時間增長底物被酶解完全,而過度的酶解可能使酶解液呈現苦味。綜上分析確定較適酶解時間為4 h。

圖11 酶解時間對水解度和感官評分的影響Fig.11 Effect of hydrolysis time on DH and SE efficiency

2.3.4 不同初始pH對酶解效果的影響 由圖12可知:當初始pH從4.5～6.0時,水解度、感官評分均上升,6.0～7.0時感官評分相差不大;當初始pH繼續增至7.0時,水解度,感官評分均有下降。程玉[12]對海鮮菇酶解條件研究中指出,pH影響底物和酶的穩定性,進而影響二者結合,過酸過堿的條件都不利于酶正常發揮活性。綜上分析,確定較適初始pH為6.0。

圖12 初始pH對水解度和感官評分的影響Fig.12 Effect of initial pH on DH and SE efficiency

2.3.5 正交實驗結果及數據分析 據表4正交實驗結果計算極差R(r),通過R(r)大小對酶解效果的影響因素進行主次排隊,比較表4中A,B,C,D四個因素中可以看出影響水解效果主次順序為:B(酶解溫度)>D(初始pH)>A(料水比)>C(酶解時間);影響感官評分主次順序為:D(初始pH)>A(料水比)>B(酶解溫度)>C(酶解時間)。以水解度為評價指標所得到最優方案為A2B3C2D2,以感官評分為評價指標所得到的最優方案為A2B3C2D2,綜上,得到最優酶解條件:酶解料水比1∶7 (g/mL),酶解溫度50 ℃,酶解時間4 h,初始pH為6.0。

表4 L9(34)正交實驗結果Table 4 Results of L9(34)orthogonal experimental

2.3.6 驗證實驗 取10 g新鮮白牛肝菌邊角料,按照最佳酶解條件和工藝進行酶解得最佳酶解液,經測定,水解度為20.16%±0.33%,感官綜合評分為(30.56±0.61)分。通過驗證實驗測出的水解度和感官評分比正交實驗中最優方案稍高,說明本實驗得到的最優酶解條件較為可靠。

3 結論

云南白牛肝菌邊角料在風味蛋白酶和木瓜蛋白酶最適條件下酶解效果最佳,所得酶解液香氣濃郁,風味獨特,可用來生產高質量風味調料,同時提高副產品利用率。白牛肝菌水分含量為88.73%,粗蛋白含量為35.4%,氨基酸含量為20.78%。風味蛋白酶復合木瓜蛋白酶的最佳酶解條件是酶添加量均為0.3%,料水比為1∶7(g/mL),初始pH為6.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為4 h。采用最佳酶解條件酶解白牛肝菌邊角料,所得酶解液蛋白質水解度為20.16%,感官評分為30.56分。

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Process optimization of enzymatic hydrolysis ofBoletusEdulisin Yunnan

LIU Jia1,2,WANG Gui-ying1,2,CHENG Zhi-bin2,GU Da-hai1,2,FAN Jiang-ping1,2,WANG Xue-feng1,2,GE Chang-rong2,LIAO Guo-zhou1,2,*

(1.College of food science and technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Yunnan Animal Products Processing Engineering and Technology Research Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

Thestudycanprovideascientificbasistothehigh-valueuseanddevelopmentforBoletus Edulis.ThebyproductsofBoletus edulisinYunnanwereusedasmaterial,thedegreeofhydrolysisandsensoryevaluationwereanalyzed.InordertostudytheprocessoptimizationofenzymatichydrolysisforpreparationofumamiextractsfromthebyproductsofBoletus EdulisinYunnan.Thestudywasbasedoninvestigationsofsingle-factor,theprocessoptimizationofenzymatichydrolysiswasstudiedbyorthogonaldesign.Theresultssuggestedthattheprocessoptimizationofflavourzymeandpapayaproteaseenzymatichydrolysiswastheadditioncontentsofflavourzymeandpapayaprotease0.3%,theratioofwater1∶7(g/mL),initialpH6.0,hydrolysistemperature50 ℃andhydrolysistime4h.UndertheprocessoptimizationofenzymatichydrolysisforthebyproductsofBoletus Edulis,thedegreeofhydrolysiswas20.16%andthesensoryevaluationwas30.56points.Thehydrolysatewasrichofaromasanduniqueflavor.Itwasusedtoproducthighqualityflavorseasoning,itcanimproveutilizationofbyproductsatthesametime.

Boletus Edulis;byproduct;degreeofhydrolysis;sensoryevaluation

2016-05-30

劉佳(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：lhc712@126.com。

*通訊作者:廖國周(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工與質量控制，E-mail：LiaoGuoZhou@ynau.edu.cn。

云南省科技計劃項目重大科技專項(2016ZA008);云南省科技計劃項目省院省校科技合作專項(2013IB010)。

TS209

B

1002-0306(2016)21-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.034