響應(yīng)面法優(yōu)化魚籽多肽酶解液脫色工藝

胡慶蘋,魏鑒騰,裴 棟,王寧麗,劉曄瑋,邸多隆

(1.蘭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所,甘肅蘭州 730000;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000;3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心,山東青島 266100)

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響應(yīng)面法優(yōu)化魚籽多肽酶解液脫色工藝

胡慶蘋1,2,3,魏鑒騰2,3,裴 棟2,3,王寧麗2,3,劉曄瑋1,*,邸多隆2,3

(1.蘭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所,甘肅蘭州 730000;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000;3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心,山東青島 266100)

采用活性炭對(duì)魚籽多肽酶解液進(jìn)行脫色,以脫色率和多肽回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別考察活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH對(duì)脫色效果的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化魚籽多肽酶解液的脫色工藝。結(jié)果表明:魚籽多肽最佳脫色工藝條件為10.5%(m/m)、時(shí)間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,在此條件下,脫色率77.51%±1.49%、多肽回收率82.26%±2.82%,與理論值差異不顯著。該脫色工藝簡單可靠,脫色效果好,多肽回收率高,為魚籽多肽產(chǎn)品后期研發(fā)提供依據(jù)。

魚籽多肽,脫色,響應(yīng)面法,脫色率,多肽回收率

魚籽是水產(chǎn)品加工中一種重要的副產(chǎn)物,富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、鈣、鐵、維生素、膽固醇等營養(yǎng)物質(zhì),目前魚籽主要用于食品加工,魚子醬是其主要的食品成品,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值,在歐洲國家有很大的需求[1-2]。魚籽多肽是由魚籽蛋白經(jīng)酶解后得到的,以分子量小于3000 u的小分子肽為主的多肽混合物[3]。魚籽酶解多肽具有良好的溶解性、乳化性能、脂肪吸附容量及起泡性能[4]。魚籽多肽是一種生物活性肽,具有降血壓、抗氧化、抗菌、提高免疫力等作用[5-6]。

魚籽多肽酶解液呈棕黃色或褐色,易引起產(chǎn)品感官不適,不利于產(chǎn)品的深度研發(fā)。目前常用的脫色劑有活性炭、大孔樹脂、復(fù)合吸附劑、強(qiáng)堿性陰離子樹脂等[7]。活性炭是一種無序微孔結(jié)構(gòu),因其價(jià)格低廉,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫、耐酸堿,良好的吸附性能,比表面積大等優(yōu)點(diǎn)在脫色工藝中廣泛使用[8-9]。

本文采用實(shí)驗(yàn)室前期制備的魚籽多肽酶解液樣品,以活性炭為脫色劑,脫色率、多肽回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察影響活性炭對(duì)魚籽多肽脫色效果的因素,并運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行脫色工藝優(yōu)化[10],以期為魚籽多肽產(chǎn)品研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚籽多肽酶解液 實(shí)驗(yàn)室自制[11];粉末活性炭;無水硫酸銅、濃硫酸、氫氧化鈉、37%甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、對(duì)硝基苯酚、乙酸鈉、乙酸等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;去離子水 實(shí)驗(yàn)室自制。

TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;紅外智能消化爐 上海沛歐分析儀器有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Sartorius PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Sartorius BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 魚籽多肽酶解液→脫色→離心(4000 r/min,5 min)→0.45 μm微孔濾膜過濾→檢測(cè)上清液。

1.2.2 脫色率 將魚籽多肽酶解液在可見-紫外光譜200～900 nm進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果顯示可見光區(qū)無吸收峰,但在380～760 nm范圍內(nèi),吸光度逐漸減小。根據(jù)脫色前后多肽溶液均為橙黃色,故從溶液的互補(bǔ)色考慮[12-14],選擇450 nm作為檢測(cè)波長,在此波長下測(cè)定多肽溶液脫色前后吸光度值,并按下式計(jì)算溶液脫色率:

脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

式(1)

1.2.3 多肽回收率 采用GB 5009.5-2010分光光度法檢測(cè)脫色前后多肽溶液中多肽含量,按下式計(jì)算多肽回收率:

多肽回收率(%)=m脫色后/m脫色前×100

式(2)

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH四個(gè)因素對(duì)魚籽多肽酶解液脫色率、多肽回收率的影響,其水平見表1。通過查閱文獻(xiàn)[15],結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本等因素,將脫色初始溫度設(shè)為50 ℃;在生產(chǎn)中,時(shí)間越短,成本越低,結(jié)合文獻(xiàn)脫色時(shí)間[16],將脫色初始時(shí)間設(shè)為30 min;本實(shí)驗(yàn)中多肽酶解液初始pH為5.55,呈弱酸性,而活性炭在酸性條件下,脫色效果佳[17],結(jié)合降低生產(chǎn)成本等因素,故將脫色初始pH設(shè)為5.55。因此固定溫度50 ℃,時(shí)間30 min,pH5.55,考察活性炭用量對(duì)脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),溫度50 ℃,pH5.55,考察時(shí)間對(duì)脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),時(shí)間30 min,pH5.55,考察溫度對(duì)脫色效果的影響;固定活性炭用量10%(m/m),溫度50 ℃,時(shí)間30 min,考察pH對(duì)脫色效果的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)魚籽多肽溶液脫色進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)[18-19],見表2,并采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of the single factor experiment

表2 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SigmaPlot 12.5軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響 由圖1可知,活性炭用量對(duì)魚籽多肽樣品的脫色效果影響顯著。活性炭脫色屬于物理脫色,其顆粒表面的空隙,可強(qiáng)烈吸附色素分子[20]。隨著活性炭用量的增加,脫色率整體呈增加趨勢(shì),但當(dāng)活性炭用量增加到12%時(shí),脫色率減小,在8%～12%用量的范圍內(nèi),脫色效果較好,結(jié)合多肽回收率,綜合考慮選擇10%活性炭用量。

圖1 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響Fig.1 Influence of activated carbon concentration on decoloring effect

2.1.2 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響 活性炭與色素分子接觸需要一定的時(shí)間,但由于本實(shí)驗(yàn)中考察脫色時(shí)間因素時(shí),溫度定為50 ℃較高,分子運(yùn)動(dòng)加劇,由圖2可知,作用時(shí)間超過20 min后,活性炭吸附可能發(fā)生解析[21]。但結(jié)合多肽回收率指標(biāo),40 min時(shí)脫色效果較好,脫色率68.97%、多肽回收率90.11%,因此選擇脫色時(shí)間為40 min,這與戴麗君[22]等在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大豆多肽脫色工藝中活性炭脫色時(shí)間40 min相同。

圖2 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響Fig.2 Influence of time on decoloring effect

2.1.3 脫色溫度對(duì)脫色率和肽回收率的影響 由圖3可知,20～40 ℃內(nèi),脫色率緩慢升高,這是由于溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加劇,色素分子更易于擴(kuò)散到活性炭的空隙結(jié)構(gòu)中,有利于吸附。當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí),脫色率達(dá)62.56%,此時(shí)多肽回收率89.66%也相對(duì)較高,因此選擇50 ℃作為最佳脫色溫度,這與徐曼[15]等粉末活性炭脫色豆粕蛋白酶解液的條件優(yōu)化中粉末活性炭脫色溫度50 ℃相同。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃以上,脫色率先基本不變后反而降低,可能原因?yàn)闇囟冗^高,導(dǎo)致活性炭吸附發(fā)生解析,已吸附的色素分子又被釋放出來。

圖3 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響Fig.3 Influence of temperature on decoloring effect

2.1.4 pH對(duì)脫色率和肽回收率的影響 活性炭吸附色素的過程需要H+的參與,適當(dāng)提高樣品中H+的濃度,可以提高脫色率[17]。由圖4可知,pH對(duì)脫色效果影響較大,隨著pH的增大,脫色率整體呈逐漸減小的趨勢(shì),在pH為2時(shí)脫色效果最佳,脫色率達(dá)78.97%,但此時(shí)多肽回收率85.08%,均較pH為3時(shí)(多肽回收率90.81%)低,綜合脫色率、多肽回收率二因素考慮選擇pH為3為最佳脫色pH,這與呂振雷[23]等在活性炭對(duì)紫貽貝蛋白酶解液脫色效果的影響中脫色pH為3相同。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化魚籽多肽脫色工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。由表4可知,以活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH為考察因素,以脫色率、多肽回收率為指標(biāo)的響應(yīng)面優(yōu)化模型中,Y1、Y2差異極顯著(p<0.01),其決定系數(shù)R2分別為0.9115、0.8254,且模型失擬項(xiàng)均無顯著性差異(p>0.01),表明魚籽多肽酶解液的脫色效果的實(shí)驗(yàn)值與擬合值之間的擬合度較好,Y1、Y2的二次模型合適。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

表4 回歸模型的方差Table 4 Variance analysis of regression model

注:**:差異極顯著(p<0.01);*:差異顯著(p<0.05);Y1:脫色率;Y2:多肽回收率。 由方差分析結(jié)果(表4)可知,Y1的A、B、D、AD、BC、BD、B2、D2對(duì)魚籽多肽酶解液的脫色率影響顯著,其中一次項(xiàng)中對(duì)脫色率影響顯著的順序?yàn)镈>B>A;Y2的A、C、D、AD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)魚籽多肽酶解液的多肽回收率影響顯著,其中一次項(xiàng)中對(duì)多肽回收率影響顯著的順序?yàn)镃>D>A。

擬合后,可以建立關(guān)于活性炭用量、時(shí)間、溫度以及pH的二次多項(xiàng)式回歸模型,分別為:

Y1(%)=75.22+2.68A+3.34B+1.57C-6.72D+0.96AB+0.060AC+3.35AD+3.55BC+3.85BD+0.038CD-0.95A2-3.00B2-1.49C2-7.17D2

Y2(%)=83.83+2.78A+0.07B+3.08C+2.78D-3.63AB+0.50AC-6.24AD-0.37BC+0.80BD-4.73CD-7.06A2-5.83B2-4.94C2-6.08D2

2.2.2 雙因素間交互作用影響 由表4可知,活性炭用量與pH、時(shí)間與溫度、時(shí)間與pH之間的交互作用對(duì)脫色率的影響顯著,分別見圖5a及5b、5c及5d、5e及5f。由圖5a和5b可知,當(dāng)時(shí)間與溫度處于最佳水平時(shí),固定pH,隨著活性炭用量的增加,脫色率緩慢增加,但增幅不是很明顯;固定活性炭用量,隨著pH的增加,脫色率呈減小趨勢(shì),降幅明顯。由圖5c和5d可知,當(dāng)活性炭用量和pH處于最佳水平時(shí),固定其中一個(gè)因素,隨著各一個(gè)因素的增加,脫色率均呈增加趨勢(shì),但增幅不是很明顯。由圖5e和5f可知,當(dāng)活性炭用量和溫度處于最佳水平時(shí),固定脫色時(shí)間,隨著pH的增大,脫色率逐漸減小;固定pH,隨著脫色時(shí)間的增加,脫色率呈增加趨勢(shì),但增幅不明顯。

圖5 脫色率響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 The response surface and contour plots of the decoloring rate

由表4可知,活性炭用量與pH,溫度與pH之間的交互作用對(duì)多肽回收率的影響顯著,分別見圖6a和6b、6c和6d。由圖6a和6b可知,當(dāng)時(shí)間與溫度處于最佳水平時(shí),固定活性炭用量,隨著pH的增加,多肽回收率呈增加趨勢(shì),整體呈先大幅增加,后趨于平緩;固定pH時(shí),隨著活性炭用量的增加,多肽回收率先增加,后趨于平緩。由圖6c和6d可知,當(dāng)活性炭用量和時(shí)間處于最佳水平時(shí),固定溫度,隨著pH的增加,多肽回收率呈逐漸增加趨勢(shì),后趨于平緩;固定pH,隨著溫度的增加,多肽回收率呈增加趨勢(shì),后趨于平緩。

圖6 多肽回收率響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.6 The response surface and contour plots of the peptide retention rate

2.2.3 魚籽多肽酶解液脫色條件的確定及優(yōu)化工藝條件驗(yàn)證 經(jīng)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),Design Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后,得到魚籽多肽溶液脫色的最優(yōu)工藝條件為:活性炭用量10.75%、時(shí)間41.47 min、溫度55.02 ℃、pH2.75,此條件下,脫色率為78.02%、多肽回收率為84.01%。為方便實(shí)際操作,將最佳脫色條件調(diào)整為活性炭用量10.5%、時(shí)間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,在此最優(yōu)條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果為脫色率為77.51%±1.49%、多肽回收率為82.26%±2.82%,可以證明模型可靠。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化魚籽多肽脫色工藝,以魚籽多肽酶解液為原液,以脫色率、多肽回收率為檢測(cè)指標(biāo),考察活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH對(duì)魚籽多肽酶解液脫色效果的影響,以得到魚籽多肽最佳脫色工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)魚籽多肽溶液脫色進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì),并采用Design Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,活性炭用量、pH對(duì)脫色率、多肽回收率均具有顯著影響,脫色時(shí)間對(duì)脫色率具有顯著影響,脫色溫度對(duì)多肽回收率具有顯著影響;活性炭用量與pH之間的交互作用對(duì)兩者均具有顯著影響,脫色時(shí)間與溫度、脫色時(shí)間與pH之間的交互作用對(duì)脫色率具有顯著影響,溫度與pH之間的交互作用對(duì)多肽回收率具有顯著影響。響應(yīng)面法優(yōu)化脫色工藝最有條件為活性炭用量10.5%、時(shí)間41 min、溫度55 ℃、pH2.8,此條件下,脫色率、多肽回收率理論值分別為78.02%、84.01%。三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為脫色率77.51%±1.49%、多肽回收率82.26%±2.82%,與理論值接近,模型可靠。該脫色工藝簡單可靠,脫色效果好,多肽回收率高,為魚籽多肽產(chǎn)品后期研發(fā)提供依據(jù)。

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Optimization of decoloring process of enzymatic hydrolysate of fish roes peptide by response surface methodology

HU Qing-ping1,2,3,WEI Jian-teng2,3,PEI Dong2,3,WANG Ning-li2,3,LIU Ye-wei1，*,DI Duo-long2,3

(1.Institute of Nutrition and Food Hygiene,faculty of Public Health,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.Center of Resource Chemical & New Material,Qingdao,Qingdao 266100,China)

Enzymatichydrolysateoffishroespeptidewasdecoloredbyactivatedcarbon.Theeffectofthedoseofactivatedcarbon,time,temperatureandpHonthedecoloringwasinvestigatedbydecoloringrateandpeptideretentionratedetected.Basedontheresultsofsinglefactorexperiments,thedecoloringprocesswasoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Theresultsshowedthattheoptimalconditionswereasfollows:theamountofactivatedcarbon10.5%(m/m),time41min,temperature55 ℃,pH2.8.Underthisoptimalconditions,thedecoloringratewas77.51%±1.49%,thepeptideretentionratewas82.26%±2.82%whichwasnotsignificantwiththetheoreticalvalue.Thedecoloringprocesswassimple,reliable,highpeptideretentionrateandhighdecoloringrate.Theresultswouldprovideatheoreticalfoundationforthedevelopmentoffishroespeptide.

fishroespeptide;decoloring;responsesurfacemethodology;thedecoloringrate;thepeptideretentionrate

2016-05-30

胡慶蘋(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail:huqp14@lzu.edu.cn。

*通訊作者:劉曄瑋(1962-)，女，碩士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail:liuyw@lzu.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2014AA022203)；國家自然科學(xué)基金(21505143)；青島市民生計(jì)劃(15-8-2-6-hy)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)21-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.028