葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸單酯的生物活性對比

朱振元,宋巧英,李盛峰

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

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葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸單酯的生物活性對比

朱振元,宋巧英,李盛峰

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

硬脂酸單酯,生物活性,抗氧化,抑菌

糖酯,是由糖與脂肪酸相互作用生成的一類有機(jī)化合物,具有抑菌[1-3]、抗癌[4]、表面活性劑[5-6]、治療疾病[7-8]和抗氧化[9]等作用。目前,對糖酯的研究逐漸成為熱點(diǎn),Ferrer M[10]等提出6-O-麥芽糖月桂酸單酯可抑制植物乳桿菌的生長,而6,6′-O-麥芽糖月桂酸二酯對微生物無明顯的抑制作用。由此可知,糖酯的酯密度對其抑菌性有顯著的影響。張希[11]提出蔗糖月桂酸二酯或多酯的抑菌活性弱于蔗糖單酯,因此單糖脂肪酸單酯的抑菌性明顯優(yōu)于二糖或多糖脂肪酸單酯。由此可推測糖酯的糖基密度對其抑菌性有顯著影響。趙磊[12]等提出糖酯中酯的碳鏈越短其抑菌性越強(qiáng),因此酯類的長度對其生物活性有影響。但尚無關(guān)于糖酯的糖基種類對其生物活性的影響,我們在前期研究工作中成功合成了一系列糖硬脂酸單酯[13](如圖1),本文將在前期工作基礎(chǔ)上通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和抑菌實(shí)驗(yàn)探討葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸單酯的生物活性并做出對比。為開發(fā)相應(yīng)的產(chǎn)品以及擴(kuò)大其在日化、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 各化合物構(gòu)型分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structures of each compound

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青霉素,DPPH-乙醇溶液,鄰苯三酚溶液分析純 阿拉丁試劑(上海)有限公司;Tris-HCl緩沖液,無水乙醇,氯化鈉,鹽酸化學(xué)純 天津江天化工技術(shù)有限公司;大腸桿菌(E.scherichiacoli)、沙門氏桿菌(SalmonellaTyphimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)、青霉(Penicillium)、和曲霉(Aspergillus) 天津科技大學(xué)生物資源與功能食品實(shí)驗(yàn)室。

α-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物1)、β-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物2)、α-D-吡喃半乳糖-1-硬脂酸酯(化合物3)、β-D-吡喃半乳糖-1-硬脂酸酯(化合物4)、O-(β-D-吡喃半乳糖)-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物5)、O-(β-D-吡喃半乳糖)-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物6)在前期研究工作中合成。

UV型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司;回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司;精密電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

式(1)

1.2.1.2 清除·OH能力的測定 參考馬建華[16]的方法。在試管中依次加入2mL濃度為20、40、60、80、100、200、300μg/mL的樣品溶液(溶劑為蒸餾水),2mL濃度為6mmol/L的FeSO4溶液,2mL濃度為6mmol/L的H2O2溶液,靜置10min,然后分別加入2mL濃度為6mmol/L的水楊酸溶液,靜置30min,于510nm的波長下測定吸光度值A(chǔ)i;扣底物組以蒸餾水代替底物水楊酸測吸光度值A(chǔ)j;對照組以蒸餾水代替樣品測吸光度值A(chǔ)0。同時(shí)用相同濃度的VC代替樣品作為陽性對照,其余步驟一致[15]。計(jì)算公式見式(1)。

1.2.1.3 清除DPPH·能力的測定 采用寇智斌等[17]的方法。取濃度為1.5×10-4mol/L的DPPH-乙醇溶液2mL,然后分別加入2mL濃度為 20、40、60、80、100、200、300μg/mL的樣品溶液(溶劑為蒸餾水),搖勻,室溫靜置30min,在517nm下測吸光度Ai;扣底物組以無水乙醇代替DPPH·與樣品反應(yīng),測吸光度Aj;對照組以蒸餾水代替樣液與無水乙醇反應(yīng),測吸光度A0。同時(shí)用相同濃度的VC代替樣品作為陽性對照,其余步驟一致[15]。計(jì)算公式見式(1)。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 培養(yǎng)基的制備 細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):參考程慶等[18]的方法配制。霉菌培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,PDA):參考顏松[19]的方法配制。

1.2.2.2 菌種的活化與菌懸液的制備 將溶化的細(xì)菌培養(yǎng)基倒入到干凈的試管中,滅菌,擺斜面。在無菌的條件下將供試菌種接入到培養(yǎng)基中,37 ℃,培養(yǎng)24h。然后制成一系列的菌懸液,濃度大約為3×108cfu/mL,備用[20-21]。

1.2.2.3 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備若干直徑6mm,長2cm的圓筒狀物體,120 ℃干熱滅菌20min,備用。將前期配制的細(xì)菌和霉菌固體培養(yǎng)基分別熔化后慢慢倒入平皿中,體積約為10mL,凝固后用無菌的鑷子取6個之前準(zhǔn)備好的圓筒狀物體間隔一定的距離插入到培養(yǎng)基中,且在培養(yǎng)基的正中央也插入一個。

細(xì)菌實(shí)驗(yàn):取100μL細(xì)菌菌懸液到15mL未凝固的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,然后倒入到插有圓柱狀物體的平皿中,凝固后,將圓柱狀物體拔出,在周圍的6個孔中分別加入100μL[24]的各樣品化合物溶液,得到400μg/mL的樣品化合物溶液。將100μL90%的無菌甲醇加入到中間的一個孔中作對照,將青霉素加入到另一個孔中作對照。每種菌做3組平行。37 ℃培養(yǎng)24h后,以十字交叉法測量抑菌圈直徑[22-23]。

霉菌實(shí)驗(yàn):將15mL熱溶的PDA培養(yǎng)基倒入到插有圓柱狀物體的平皿中,凝固后,將圓柱狀物體拔出,用無菌的涂布器將100μL(3×108cfu/mL)霉菌菌懸液涂布在培養(yǎng)基上,在周圍的6個孔中分別加入100μL(400μg/mL)[24]各樣品化合物溶液,將100μL90%的無菌甲醇加入到中間的孔中做對照。每種菌做3組平行。28 ℃培養(yǎng)48h后,以十字交叉法測量抑菌圈直徑[22-23]。

1.2.2.4 生長曲線的繪制 將提前準(zhǔn)備好的干凈試管分為空白對照組和加藥組,加藥組又分為6個樣品化合物(1,2,3,4,5,6),空白與每個樣品均做3組平行。在試管中分別加入4mL細(xì)菌液體培養(yǎng)基,0.1MPa高壓滅菌20min,備用。在超凈工作臺中向各試管中加入0.5mL的菌懸液,加藥組加0.5mL樣品溶液(溶劑為甲醇,終濃度為300μg/mL);空白組加0.5mL甲醇做對照。37 ℃,150r/min培養(yǎng)。將對照組和加藥組的試管按照編號順序分別于0、3、6、9、12、24、36、48h分段取出,吹吸均勻,于波長600nm處測吸光度,根據(jù)OD值繪制出生長曲線[25]。

化合物濃度(μg/mL)20406080100200300化合物123.3±0.1a31.1±0.1a40.9±0.8a45.1±0.2a55.2±0.7a64.7±0.5a65.1±0.9a化合物223.1±0.5a30.2±0.2a39.7±0.8a47.8±0.5a55.1±0.4a64.2±0.4a66.1±0.3a化合物326.1±0.3a28.2±0.6a36.9±0.3a45.1±0.7a55.7±0.8a65.7±0.7a67.2±0.6a化合物426.2±0.7a28.9±0.3a36.8±0.5a46.2±0.9a56.1±0.2a65.9±0.3a66.1±0.2a化合物522.2±0.6a28.7±0.2a39.2±0.7a44.8±0.5a52.9±0.9a61.1±0.9a60.2±0.1a化合物623.2±0.4a29.1±0.3a38.9±0.8a45.9±0.2a54.2±0.1a62.1±0.3a62.3±0.8aVC56.2±0.3b64.3±0.8b69.4±0.1b73.1±0.9b79.8±0.7b82.3±0.7b88.6±0.4b

注:數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值,同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相同、不同分別表示差異不顯著(p>0.05),顯著(p<0.05)表2,表3同。

化合物濃度(μg/mL)20406080100200300化合物118.2±0.1a22.8±0.1a30.1±0.8a42.9±0.2a55.1±0.7a63.9±0.5a64.3±0.9a化合物218.3±0.5a23.2±0.2a30.3±0.8a43.1±0.5a55.9±0.4a65.1±0.4a64.5±0.3a化合物319.2±0.3a24.7±0.6a31.1±0.3a39.9±0.7a51.2±0.8a61.8±0.7a60.2±0.6a化合物420.2±0.7a25.1±0.3a30.9±0.5a40.2±0.9a51.9±0.2a61.2±0.3a61.2±0.2a化合物519.1±0.6a21.4±0.2a30.2±0.7a39.8±0.5a54.2±0.9a59.5±0.9a59.4±0.1a化合物619.2±0.4a21.2±0.3a29.7±0.8a40.5±0.2a53.4±0.1a60.1±0.3a60.2±0.8aVC48.8±0.6b54.6±0.3b65.3±0.9b72.9±0.5b81.8±0.6b89.7±0.4b93.2±0.5b

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析采用EXCEL和SAS 9.3軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.1.2 清除·OH能力的測定 如表2所示,化合物1～6對·OH具有一定的清除能力,在20～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),清除率與濃度成正相關(guān),隨著濃度的增大而增大。當(dāng)濃度大于200 μg/mL時(shí),各質(zhì)量濃度的化合物對·OH的清除率變化不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,同一質(zhì)量濃度的各化合物清除·OH的能力差異不顯著。雖然不同濃度下各化合物對·OH的清除率低于陽性對照VC,但已表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力。

2.1.3 清除DPPH·能力的測定 如表3所示,化合物1～6對DPPH·具有一定的清除能力,在20～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),清除率與濃度成正相關(guān),即隨著濃度的增大而增大,當(dāng)濃度大于200 μg/mL時(shí),各質(zhì)量濃度的化合物對DPPH·的清除率變化不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,同一質(zhì)量濃度的各化合物清除DPPH·的能力差異不顯著。雖然不同濃度下各化合物對DPPH·的清除率低于陽性對照VC,但已表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力。

表3 各化合物清除DPPH·能力對比Table 3 The ability of cleaning DPPH· of each ±SD,n=3)

表4 不同化合物對細(xì)菌的抑制效果Table 4 Effects of different compounds on the bacteria

注:數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值(包括中間孔的直徑6 mm);同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相同、不同分別表示差異不顯著(p>0.05),顯著(p<0.05);抑菌圈直徑大于6 mm者判為有抑菌作用,抑菌圈直徑小于或等于6 mm者判為無抑菌作用,表5同。

表5 不同化合物對霉菌的抑制效果Table 5 Effects of different compounds on the mold

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 抑菌圈測定實(shí)驗(yàn) 如表4所示,由抑菌圈直徑的大小可以看出化合物1～6對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌這四種菌都具有一定的抑制作用,但抑菌效果比青霉素弱,相對于甲醇空白組抑菌效果明顯。且六種化合物的抑菌能力基本相當(dāng),無顯著性差異。

如表5所示,由抑菌圈直徑的大小可以看出,化合物1～6對霉菌(根霉、毛霉、青霉和曲霉)的抑菌效果不明顯,各化合物之間沒有顯著性差異,且比甲醇抑菌效果弱,說明這六種化合物對霉菌的抑制作用較弱。

2.2.2 生長曲線測定實(shí)驗(yàn) 通過在不同時(shí)間段測定菌懸液在波長為600 nm處的吸光值(OD值)來繪制受試菌的生長曲線,然后根據(jù)生長曲線的變化來判斷抑菌效果,吸光值越小,活菌的數(shù)量值越小,抑菌效果越好。

如圖2～圖5所示,根據(jù)吸光值的大小可以看出化合物1～6對細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏桿菌)均有一定的抑制作用。在培養(yǎng)期間加藥組的活菌數(shù)始終少于對照組活菌數(shù),表明化合物在停滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期均抑制了受試菌的生長,且各化合物的抑菌能力比甲醇的抑菌能力強(qiáng)。且整個時(shí)間段內(nèi)各加藥組的活菌數(shù)基本相當(dāng),表明這六種化合物的抑菌能力基本相當(dāng)。

圖2 各化合物對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.2 The growth curve of E.coli affected by each compound

圖3 各化合物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.3 The growth curve of Staphylococcus aureus affected by each compound

圖4 各化合物對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響Fig.4 The growth curve of Bacillus subtilis affected by each compound

圖5 各化合物對沙門氏桿菌生長曲線的影響Fig.5 The growth curve of Salmonella affected by each compound

3 結(jié)論

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Comparison of the biological activity of glucose,galactose and lactose stearate

ZHU Zhen-yuan,SONG Qiao-ying,LI Sheng-feng

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Science and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

stearicacidester;biologicalactivity;antioxidation;antibacterialactivity

2016-05-10

朱振元(1969-)，男，博士，教授，研究方向：生物資源與功能食品，E-mail:zhyuanzhu@tust.edu.cn。

國家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2015GA610001)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)21-0086-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.008