生物傳感器測定農藥類污染物2,4-D的檢測方法研究

和建萍　 潘學軍　 周小紅　 施漢昌　清華大學　昆明理工大學

生物傳感器測定農藥類污染物2,4-D的檢測方法研究

和建萍1,2潘學軍2周小紅1施漢昌11清華大學2昆明理工大學

平面波導型熒光免疫傳感器(PWFI)是一種基于全內反射熒光和免疫分析原理的具有高靈敏度的生物傳感器。本研究基于PWFI傳感器，利用間接免疫反應原理，實現了對農藥類小分子污染物2,4-D的檢測，建立了運用PWFI傳感器測定農藥類小分子污染物的檢測方法。為水環境保護和突發性污染事故應急監測等提供快速、簡便、有效的技術支持。

生物傳感器；檢測；污染物；農藥

農藥在人類的農業生產中為防治病蟲草害發揮了重要的作用，但也帶來了環境污染問題。農藥是化學藥品中毒性較高，降解緩慢的物質，經過長期積累、富集、遷移、轉化，在大氣、水體、食物鏈等介質中擴散傳遞，使環境空氣、環境水體、環境土壤和食物都受到不同程度的污染，危害人類健康。何光好于1998年對全國109,700km河流進行的評價結果表明有70.6%的河流受到農藥的污染[1]。大量研究結果顯示，長江、黃河、湖泊、水庫、海域等水體中均檢出有毒有機污染物質[2]，有毒有機物引起的水環境污染問題已成為世界普遍關注的環境問題。

常用的微量有毒有機污染物檢測技術主要有：氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）[3]、氣液相質譜聯用（GC-MC）等，這些技術能靈敏準確地檢測各種不同環境樣品中的有機污染物，但由于所用的儀器昂貴，使用環境要求較高，操作技術復雜，須由專業技術人員運行管理，維護成本高等，廣泛普及應用于一般環境監測機構還有很大的局限性。另外，在檢測過程中要求對樣品進行復雜的預處理，耗時長，時效性差，不能滿足環境污染事件現場應急監測的工作需要。生物傳感器是一類基于生物分子與污染物的特異性反應對污染物進行識別，并通過光學或電化學方法獲取信號的檢測系統。近年，生物傳感器的快速發展為其應用于環境中微量有毒有機物的檢測展示了廣闊的前景。本文介紹了基于平面物波導-熒光免疫生物傳感器測定農藥類污染物——2,4-D的檢測方法研究。

1 實驗儀器與材料

本研究采用了清華大學環境學院研發的平面波導型熒光免疫傳感器系統，如圖1所示。平面波導型熒光免疫傳感器系統由光路系統、流動進樣系統、信號處理系統三部分組成[4]。其中，光路系統主要包括激發光路和熒光收集光路；流動進樣與反應系統主要包括免疫芯片、反應池、進樣閥和微量計量泵；信號處理系統主要包括控制電路和信號處理電路。

圖1　平面波導型熒光免疫傳感器系統

試驗材料包括：修飾后具有特異性反應點位的免疫芯片。Cy5.5標記的2,4-D抗體（研究組自備），抗體稀釋液（研究組自備），2,4-二氯苯氧乙酸使用原液（2,4-D，Aldrich）（研究組自備），10mmol/L的PBS緩沖溶液，pH=1.9，濃度0.5%的SDS活化試劑，磷酸（H3PO4，分析純），氯化鈉（NaCl，分析純），氯酸鉀（KCl，分析純），磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純），磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O，分析純），超純水。（注：所用試劑除購自Sigma的試劑外，其余試劑均為國內生產的分析純試劑）。

2 免疫芯片的修飾

檢測的核心元件是對2,4-D具有特異性免疫反應的生物芯片。因此，首先要對玻璃傳感基片進行清洗和表面羥基化，然后將基片浸入2%的3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MTS）溶液，在基片表面引入巰基，將巰基化的基片用無水甲醇清洗，吹干備用。將巰基化的基片浸沒在0.002mol/L的N-琥珀酰胺基-4-馬來酰胺-丁酸脂（GMBS）雙功能試劑中（GMBS可與巰基和氨基發生反應），雙功能試劑與基片表面結合，然后將15μl的2,4-D復合抗原溶液滴加于基片表面的檢測點位上，在4℃冰箱內放置過夜以保證反應完全，經過反應形成對2,4-D具有特異性吸附的檢測芯片。為了降低非特異性吸附對2,4-D檢測的干擾，需要對芯片產生非特異性吸附的表面進行封閉。將清洗干凈的上述芯片浸沒于2mg/ml的BSA溶液中60min，反應完全后用高純水沖洗干凈，用氮氣吹干。最后，在芯片垂直切面的一段0.5cm處涂上一薄層黑漆以吸收剩余的激發光。至此，2,4-D檢測生物芯片制備完成。

3 數據分析方法

用平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類污染物2,4-D的方法，是建立在間接競爭模式基礎上的，在本研究中，先將小分子配基固定到傳感芯片上，然后將經熒光標記的抗體和待測樣品中的抗原經過進樣系統定量混合，使混合溶液預先預反應一段時間后，再將其通過進樣系統輸送到反應池進行反應，此時混合樣品中剩余的帶有熒光標記的抗體再與固定在傳感芯片上的抗原結合，測定系統響應信號。在這種檢測模式下，待測樣品中的抗原越多，反應后剩余熒光標記抗體就會越少，能與固定傳感芯片上的抗原結合的熒光標記抗體也就越少，系統的檢測響應信號就越弱，反之信號就越強，兩者間呈負相關系。標準曲線是進行數據分析的基礎，也是實現定量關系的主要依據，同時也是驗證檢測方法的靈敏度的主要依據。在本研究中標準曲線是指描述檢測信號值與抗原濃度的關系曲線，也稱為劑量-效應曲線，檢測方法的關鍵是在以上優化檢測條件下，能夠制作具有重復性的標準曲線，用以驗證檢測方法的靈敏性、準確性和重現性。

基于平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類污染物2,4-D的方法是建立在間接競爭模式基礎上的，所以標準曲線是在半對數坐標體系下的反S型曲線，通常可用四參數的數學函數模型即Logistic模型模擬，可具有很好的效果。

試中，χ—表示標準物質的濃度（或待沒物質的濃度）；

y—表示X對應的系統響應信號值；

χ0—表示曲線的中點；

A1—是上端漸近線（X=0）；

A2—是下端漸近線（X→∞）；

P—為曲線拐點處斜率。

檢測區間：也稱有效檢測范圍，指在限定誤差滿足預定要求的的前提下，特定方法的測定下限至測定上限之間的濃度范圍，在此范圍內能夠準確地定量測定待測物質的濃度或量。此處我們定義系統檢測響應信號最大值的20%～80%間的區域對應的χ值[χ1，χ2]為檢測方法的檢測區間；

檢測限：檢測限為定量范圍的兩端，分別為測定上限與測定下限。測定上限是在限定誤差能滿足預定要求的前提下，用特定方法能準確地定量測定待測物質的最大濃度或量，稱為該方法的測定上限，對沒有（或消除了）系統誤差的特定分析方法的精密度要求不同，測定上限也將不同；測定下限是在測定誤差能滿足預定要求的前提下，用特定方法能準確地定量測定待測物質的最小濃度或量，稱為該方法的測定下限，它能準確反映出分析方法能定量測定低濃度水平待測物質的極限可能性，本研究方法定義系統檢測響應信號最大值的95%對應的濃度值χ3為檢測方法的檢測下限。

IC50值：定義系統檢測響應信號最大值的50%對應的濃度值χ0為檢測方法的IC50值，亦稱檢測方法的半抑制濃度。

為了方便,我們通常將檢測數據進行歸一化處理后再做成標準曲線,經過歸一化處理的標準曲線即可以對不同批次測定出的標準曲線進行比較,也可以用于不同傳感芯片繪制的標準曲線進行比較。歸一化的標準曲線的縱坐標值用%B/B0比值的形式表示，意義是測定樣品時傳感系統的最大有效響應信號值的最大值的比值，且比值在100%（當=A1時，上端漸近線）至0%（=A2，下端漸近線）之間，公式為：

4 實驗結果和討論

4.1標準曲線的測試

標準曲線系列測試結果如圖2和圖3歸一化處理后的儀器檢測標準曲線及圖4.3標準曲線的模擬參數表所示。

圖2　系統對2,4-D標準系列溶液的響應情況

從圖2系統對0μg/L、0.5μg/L、3μg/L、8μg/L、30μg/L、50μg/L、80μg/L、100μg/ L、300μg/L、500μg/L，共10個2,4-D標準系列溶液的響應峰可以看出，選用上述優化條件：標記抗體濃度1.2μg/ml，進樣時間300s，預反應時間180s，對濃度為1μg/L、5μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L、10,000μg/L的2,4-D標準系列溶液進行測試，系統響應成一定的規律性性梯度。

圖3　歸一化處理后的儀器檢測標準曲線

從圖3歸一化處理后的儀器檢測標準曲線可知，系統響應值對2,4-D標準系列溶液濃度可以繪制出一條完整的標準曲線，說明在上述優化條件下，傳感器系統與2,4-D標準系列濃度間是符合Logistic模型的。

表1　標準曲線的模擬參數

模擬的符合程度從表1標準曲線的模擬參數表中可知，符合度R2=0.9967。在數據分析方法中，我們定義系統檢測響應信號最大值的20%～80%間對應區域的X值[X1，X2]為檢測方法的檢測區間，所以在這個優化的檢測條件下，檢測的儀器標準曲線模擬得出的定量檢測區間為9.3～158.6μg/L；定義系統檢測響應信號最大值的95%對應的濃度值X3為檢測方法的檢測限，曲線模擬得出的該檢測方法的檢出限為1.9μg/L；定義系統檢測響應信號最大值的50%對應的濃度值X0為檢測方法的IC50值，亦稱檢測方法的半抑制濃度，曲線模擬得出的IC50值為37.28μg/L。

4.2檢測周期與重現性測試

我們對平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類小分子污染物2,4-D的檢測條件進行了優化，經過在優化條件下進行標準曲繪制，可以明確經優化的檢測條件下檢測農藥類小分子污染物2,4-D，可以使檢測具有快速簡便性、高靈敏性、準確性、可靠性等優點。本方法一個完整的檢測周期只需15min，比現有的其它儀器分析方法在檢測方法上更簡便，所用檢測周期更短。既可用于實驗室分析方法，也可用于野外應急快速檢測方法。

為了檢驗傳感芯片的使用期壽命（即芯片的檢測使用周期），在本研究過程中，所有測試過程只使用了一個芯片，經過完成整個研究的測試工作后，芯片使用次數達到200次。為了研究芯片的實際使用壽命，對使用了200個檢測周期后的芯片進行了19次重復性和穩定性測試，結果如圖4所示。

圖4　　檢測方法的重現性測試

從圖4檢測方法的重現性測試可以確定，平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類小分子污染物2,4-D時，用本研究方法修飾的免疫傳感芯片具有多次重復使用的性能，在使用次數超過200次后，傳感芯片仍然具有良好的重現性，即穩定性。在該檢測條件下重復測試19次，儀器的精密度可以達到2.4%，證明本研究方法研制的免疫傳感芯片檢測壽命周期大于200次，在實際使用過程中一個傳感芯片可以重復使用200次以上，既可以快速簡便地進行檢測，還可以大大節省檢測費用，利于本研究成果在環境監測領域的普及使用。

4.3檢測精密度及回收率

加標回收率的測定是在測定樣品時，于同一樣品的子樣中加入一定量的標準物質進行測定，將其測定結果扣除樣品的測定值，以計算回收率。加標回收率的測定可以反映測試結果的準確度，當按照平行加標進行回收率測定時，所得結果既可以反映測試結果的準確度，也可以判斷其精密度。為了判斷利用平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類小分子污染物2,4-D方法的準確度、精密度及回收率，本研究對實際水樣進行了加標回收率測試。

樣品加標回收率和計算方法：在測定樣品的同時，于同一樣品的平行樣中加入一定量的標準物質進行測定，將其測定結果扣除樣品的測定值，以計算回收率，計算公式如下：

回收率（%）=（X2-X1）/X×100%

4.4樣品的采集

為了對實際水樣進行加標測試,驗證平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類小分子污染物2,4-D方法的準確度、精密度及回收率，我們采集清華大學自來水作為飲用水,清華大學近春園水樣作為地下水,圓明園水樣作為地表水進行了加標回收率測試。樣品詳細信息如表2所示。

表2　　測試樣品情況表

4.5農藥類小分子污染物2,4-D實際水樣加標回收率的測試與討論

測試條件：帶標記的2,4-D抗體濃度1.2mg/ ml；進樣時間選擇設置上述優化后的進樣時間300s（即5min），預反應時間設置為上述優化時間180s（3min）。

（1）水樣的測定：在上述條件下對水樣進行設置平行測試3次，記錄測試結果。

（2）同一水樣分取平行雙樣，分別加入2,4-D標準溶液，使平行雙樣中2,4-D濃度分別為1μg/L及2μg/L，對每個加標水樣設置平行測試3次，記錄測試結果。

實際水樣的檢測結果及水樣加標回收測試結果如表3農藥類污染物2,4-D的實際樣品測試結果所示。

表3　農藥類污染物2,4-D的際樣品測試(平行測試次數n=3)

從表3中可以看出，水樣中含2,4-D濃度都低于最低檢測限1.9μg/L，可以認為水樣中未檢出農藥類小分子污染物2,4-D。所有水樣的加標回收后，加標回收率在88%～111%區間，所有水樣檢測的變異系數都小于10%，表明基于平面波導型熒光免疫傳感器的農藥類污染物2,4-D的檢測方法具有很好的精密度、準確度及穩定性，可以確定，平面波導型熒光免疫傳感器檢測農藥類小分子污染物2,4-D檢測方法是有效可行的。

5 結論

為了確保平面波導型熒光免疫傳感器對2,4-D的檢測方法的準確性和可靠性，在經過優化的檢測條件下，對方法的檢測性能從檢測曲線的繪制、實際樣品的測試、實際樣品中加標回收率的測試、對使用了200次測試周期的傳感免疫芯片進行重復性測試等方面進行了檢測方法的性能檢驗性研究。

1.標準曲線的繪制結果說明，本檢測方法傳感器系統與2,4-D標準系列濃度間是符合Logistic模型的，模擬的符合程度符合度R2=0.9967，定量檢測區間為9.3～158.6μg/L；方法的檢出限為1.9μg/L；半抑制濃度IC50值為37.3μg/L。

2.對測試過200次后的傳感芯進行的重復性測試結果表明，傳感芯片經過200次以上的周期后，儀器的精密度仍可達到2.4%，表明本方法研制的免疫傳感芯片可以重復使用檢測200次以上，既可以快速簡便地進行檢測，還可以大大節省檢測費用，利于本研究成果在環境監測領域的普及使用。

3.加標回收率測試結果說明，方法的加標回收率在88%～111%區間，且水樣檢測的變異系數小于10%，檢測方法具有很好的精密度、準確度及穩定性，可以確定，檢測方法是有效可行的。

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The Planar Waveguide Florescence Immuno-sensor (PWFI) is a kind of high sensitive bio-sensor which based on the principles of Total Internal Ref ection Fluorescence and Immunoassay. This paper introduces to establish a detection method of small molecules pesticide pollutant-2,4-D by using PWFI bio-sensor. This method can be used to the rapid detection and early warning of pesticide pollutions as a support to the protection of water environment.