茶園芽孢桿菌QM7促生特性及耐酸鋁機制初步研究

羅毅，蘇有健，張永利，夏先江，宋莉，王燁軍，廖萬有

安徽省農業科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

茶園芽孢桿菌QM7促生特性及耐酸鋁機制初步研究

羅毅，蘇有健，張永利，夏先江，宋莉，王燁軍，廖萬有*

安徽省農業科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

目前含芽孢桿菌等微生物制劑的有機肥料在酸性茶園土壤中的生物活性不高，難以起到有效的促生作用，達到部分替代和減少化肥使用量的目的。本實驗分離得到1株耐酸鋁芽孢桿菌，命名為QM7。試驗發現菌株促生能力受到鋁離子濃度的影響，在無鋁條件下菌株生長素（IAA）的分泌量為85.6mg·L-1，當鋁離子濃度為1mmol·L-1時IAA分泌量為36.8mg·L-1；盆栽結果表明，在6周內菌株可以增加茶苗根系表面積56.8%，根尖數27.3%；蛋白電泳分析發現高濃度的鋁脅迫會導致菌株胞內64種與轉錄、翻譯和代謝相關蛋白的表達發生差異，使得菌株生長受到抑制。

茶園土壤；耐酸鋁芽孢桿菌；生長素（IAA）；蛋白電泳

茶樹〔Camellia sinensis (L.) O. Kuntze〕是典型的喜酸作物，適宜生長的土壤pH值范圍為3.2～6.0。長期栽培茶樹會導致茶園土壤酸化不斷加重，土壤中活性鋁的含量顯著增高[1]。鋁對土壤中絕大多數有益微生物會構成危害[2-3]，不利于有機質的礦化、氮素的固定及土壤養分的轉化，是茶園等酸性土壤質量提升的主要障礙因子。近年來隨著環境酸化問題的日益嚴重，特別是化肥的過度使用，加速了土壤酸化及鋁的溶出，使得酸性土壤養分失調和生態失衡問題愈加嚴重[4]。借助耐酸鋁微生物的代謝系統對活性鋁的適應作用來提高土壤生物活性是未來酸性土壤改良的發展方向之一[5]。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）是最常見的根際促生細菌之一，其生理特性豐富多樣，對人畜無毒無害，不污染環境，對根系環境具有良好的適應性，因而已被作為防治土傳病害，提供植物營養的微生物有機肥類產品而廣泛應用于農業生產中[6-7]。一些文獻也報道了在茶園中將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）作為生物藥劑，防治真菌病害[8-9]。然而，在酸性土壤中，上述菌株由于鋁的毒害作用，定殖和促生能力有限。學者通常將對鋁的耐受性＞1mmol·L-1的微生物定義為耐酸鋁菌[10]，對其中的一些微生物研究發現，鋁作用于細胞壁、細胞膜、細胞核和細胞器，影響微生物的物質和能量代謝，抑制微生物的生長。針對這些毒害作用，微生物通過多種途徑進行緩解，包括保持細胞壁和膜的完整性和流動性[11]、改變參與三羧酸（TCA）循環途徑中不同酶的活性，調節檸檬酸、草酸和蘋果酸等有機酸的含量等[12]。目前發現的大多數芽孢桿菌對鋁的耐受性低，100μmol·L-1的Al3+就會引起細胞中毒[13]，因此對其耐酸鋁機理的報道較少，故加強此方面的研究有助于更廣泛地使用芽孢桿菌等根際促生菌制劑在茶樹栽培上的應用。

本研究分離出一株耐鋁特性較好的促生芽孢桿菌，研究它在茶園土壤中對茶樹根系的促生效果和鋁脅迫下蛋白表達的差異，旨在為提高芽孢桿菌在酸性茶園土壤環境下的生物活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和培養基

1.1.2主要試劑及儀器

細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶、T載體和連接酶等均為Takara生物工程(大連)有限公司產品。根系掃描儀10000XL（美國愛普生公司）、超聲細胞破碎儀（浙江新芝）、電泳儀（SE-600全套電泳設備，美國GE公司）、光密度掃描儀（美國GE公司）、4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer質譜儀（美國ABI）。

1.2研究方法

1.2.1耐酸鋁芽孢桿菌的分離

采集地表下10～30cm深的新鮮土樣10g，放入90mL無菌水中振蕩10min，70℃水浴15min，轉接10mL懸浮液到90mL的S-LB液體培養基（含1mmol·L-1Al3+）中振蕩培養過夜，然后吸取培養液涂抹于S-LB固體培養基平板上（含1mmol·L-1Al3+）30℃培養，待有明顯的菌落生成，用接種環挑取菌落，按平板劃線法分離純化，直至獲得純菌株。

1.2.2菌株的鑒定

菌株基因組DNA的提取采用試劑盒法，使用通用引物B27F（5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′）和U1492R（5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′）擴增細菌的16S rDNA基因，PCR產物連接到TaKaRa pMD19-T Vector上，轉化大腸桿菌E. coli DH 5α進行克隆，經過藍白斑篩選和B27F和U1492R引物PCR擴增檢測陽性克隆和測序。序列在GenBank數據庫中檢索分析。選取相似菌種的16 S rDNA基因序列下載，構建系統進化樹，分析菌株親緣關系。

在混合料拌和過程中，嚴格控制拌和樓集料級配，嚴禁出現隨意放料的情況。攤鋪和碾壓時要嚴格按照施工工藝進行，壓實度要控制在95%～100%范圍內，平整度要滿足《公路瀝青路面施工技術規范》要求，其母體瀝青混合料具體質量檢查標準如表2所示。

1.2.3菌株QM7促生特性的測定

用Salkowski比色法[14]進行分泌生長素的測定。將菌株培養液（Al3+濃度為0、1mmol·L-1）于10 000 r·min-1，4℃條件下離心10min，取上清液2mL加等量比色液在黑暗中靜置30min，立即在波長530nm下測定吸光度。標準曲線采用IAA標準品（Sigma）制作。盆栽試驗選取長勢一致的茶苗用2%的次氯酸鈉表面消毒10min，用無菌水反復沖洗后，每株移栽于5 kg滅菌茶園土壤中（濕熱滅菌121℃，2 h），土壤有機質含量17.35g·kg-1，全氮含量1.12g·kg-1，速效磷含量30.46mg·kg-1，速效鉀含量85.23mg·kg-1，活性鋁含量224.12mg·kg-1，pH4.52。將芽孢桿菌QM7接種于LB培養基中，170 r·min-1，30℃培養48 h，離心去除培養基（6 800 r·min-1，10min），用無菌水水洗兩遍離心后，菌體重懸于無菌水，接入菌體到盆栽土壤（通過稀釋涂布法確定最終含量為每克土107個菌群），對照加等量無菌水。每個處理20個重復，室外自然生長6周后，測定根長、根直徑、根面積和根尖數。

1.2.4菌株QM7耐鋁特性的測定

將活化后的細菌培養物離心，無菌蒸餾水洗滌2次，重新懸于無菌蒸餾水中調節A600至1.0，接種環劃線接種于含不同鋁離子濃度（Al3+：0、1.0、1.5mmol·L-1）的固體S-LB培養基上，以不含鋁的S-LB為對照，30℃培養，3 d后觀察培養結果。

1.2.5鋁脅迫下菌株QM7胞內蛋白表達差異

將對數生長期的菌株QM7培養液分成等量兩份離心，并用無菌蒸餾水洗滌2次，分別重懸于Al3+濃度為1mmol·L-1（pH4.5）、0.5mmol·L-1（pH5.0）和無鋁（pH 7.0）的S-LB液體培養基中，170 r·min-1，30℃培養30min后離心收集菌體。樣品送生工生物工程（上海）公司，按照二維（2-D）蛋白電泳法和質譜串聯技術檢測[12]。數據經Mascot蛋白數據庫比對，離子得分大于63（Ions scores＞63）為陽性結果，選取差異蛋白列表，分析鋁脅迫下菌株QM7的響應機制。

1.2.6數據分析

盆栽實驗和蛋白電泳實驗各設2個重復，兩次結果相似。實驗數據使用SPSS，version 17.0軟件進行方差分析和多組樣本間差異顯著性分析（Duncan’s multiple range tests, P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1耐酸鋁芽孢桿菌的分離和鑒定

用pH 4.5，Al3+濃度為1mmol·L-1的培養基做篩選培養基，結合70℃水浴15min，從10份不同的茶園土壤樣品中最終分離得到1株耐酸鋁特性較好的細菌菌株，命名為QM7。菌株形態及革蘭氏染色結果表明QM7為桿狀陽性菌。16 S rDNA測序后，所得序列均已提交到GenBank（登錄號：KM894175）。通過與GenBank中的已知序列進行BLAST比對后發現，與數據庫中枯草芽孢桿菌的16 S rDNA序列相似度為99%，根據比對結果，將DNA序列與已發表的相關序列進行系統進化分析（圖1）。

2.2菌株QM7促生特性的測定

采用Salkowski比色法判斷菌株是否分泌生長素。結果表明，菌株QM7的培養液可以與顯色液結合呈現粉紅色，說明它具有生長素分泌能力。生長素定量測定結果表明，1mmol·L-1鋁脅迫導致菌株生長素的分泌量由對照的（85.6±8.2）mg·L-1減少至（36.8±9.6）mg·L-1，較對照減少了57.0%，差異極顯著（P＜0.01）。根系掃描結果（表1）顯示，種植6周后QM7處理的茶苗根系與對照相比有顯著增長，同時根面積增加56.8%，根尖數增加27.3%，而對根系直徑的促進效果不顯著，表明QM7可以有效地促進茶苗側根的發育，有利于扦插茶苗的生根。

圖1　基于菌株QM7的16 S rDNA序列構建的系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16 S rDNA sequences of strains QM7 using the neighbor-joining method

表1　根生長測定Table 1 Rootgrowth assay

2.3菌株QM7耐鋁特性的測定

分別用鋁濃度為0、1.0、1.5mmol·L-1的S-LB培養基測定QM7對鋁的耐受能力。結果表明，鋁離子會影響QM7的生長，但在鋁離子濃度為1mmol·L-1時菌落仍可以生長，當鋁離子濃度達到1.5mmol·L-1時則完全抑制了菌株生長（圖2）。說明菌株QM7有一定的耐鋁特性，對鋁離子的耐受濃度介于1.0～1.5mmol·L-1之間。

2.4鋁脅迫下菌株QM7胞內蛋白表達差異

蛋白電泳圖譜（圖3）顯示，與對照相比鋁處理后的菌株QM7有64種胞內蛋白的表達量呈現差異變化，隨著鋁離子濃度的增加部分蛋白如電泳點號為8119、2134和2410等的濃度逐漸增加，點號為4225、4118和4115等蛋白的濃度逐漸減少。切膠測序結果見表2，從表2中可以看出7種蛋白表達量增加10倍以上，4種蛋白的表達量僅為對照的1/4（P＜0.01）。蛋白序列比對后分析發現，差異蛋白主要由分子伴侶、響應調控因子、代謝酶、復制、轉錄和翻譯等構成。對結果的研究發現，通過改變參與三羧酸（TCA）循環途徑中不同酶的活性，調節檸檬酸、草酸和蘋果酸等有機酸的含量螯合鋁可能是QM7響應鋁脅迫的主要機制之一。然而，鋁對菌株QM7的DNA和蛋白的毒害作用仍不可避免，復制延長因子（FusA）和核糖體蛋白（RplA L1 and L6）受到鋁離子的影響，會導致復制和翻譯過程中錯誤率的增加。

圖2　S-LB培養基上QM7生長情況Fig. 2 QM7growth on S-LB medium

表2　MALDI-TOF肽指紋圖譜識別鋁脅迫下QM7胞內差異蛋白Table 2 Identification of changed proteins of strain QM7 under Al- stress using MALDI-TOF peptide mass mapping

3 結論與討論

茶園土壤中，活性鋁的含量較高，導致促生微生物的數量較少，生物活性作用不明顯[15-16]，阻礙了茶園生態系統的健康發展。大多數細菌的耐鋁能力往往較弱，當鋁濃度達到100μmol·L-1甚至50μmol·L-1時，就能夠抑制短根瘤菌（Bradyrhizobium spp.）的生長[17]。本實驗所用菌株QM7在1mmol·L-1鋁濃度下仍能生長，具備了耐酸鋁細菌的基本特征，但其生長素的分泌量在鋁作用下顯著下降，因此促生效果低于趙青云等對中性土壤中促生菌的研究結果[18-19]。目前在茶園中用微生物有機肥料部分替代化肥對茶葉促生和增產的報道還較少，推測其原因是多數根際促生菌株在鋁脅迫下生長和代謝能力受到抑制，導致生長素的合成能力下降，促生效果不明顯[13]。

圖3　QM7胞內蛋白電泳圖Fig. 3 Intracellular protein electrophoresis of QM7

近年來對芽孢桿菌響應外界環境脅迫的機理研究發現，酸、熱和養分脅迫下，菌株通過增強乙酰輔酶A和調控因子σB的表達調節糖代謝途徑來緩解環境壓力[20-21]。除此之外，糖異生過程FadN蛋白的上調使得更多的脂肪酸進入TCA循環中[22]。檸檬酸、草酸和蘋果酸對鋁的螯合能力大于其他有機酸類，因此調節上述有機酸含量，是菌株改變對鋁耐受能力的有效手段之一。同時，QM7通過上調乙酰乙酸乙酯酶（Adc）、2,6-α氧化還原酶（AcoA）、NADH丁醇脫氫酶（YugJ）去除TCA循環中的副產物[23]。從能量代謝的角度分析，鋁離子通過模擬Fe3+干擾TCA循環和氧化磷酸化等細胞代謝過程，降低電子傳遞鏈組分復合物酶的活性，使得細胞處于缺能狀態。QM7可能通過α-酮戊二酸脫氫酶（OdhA），將琥珀酰輔酶A轉化成琥珀酸，這一過程是底物水平磷酸化，在保證細胞能量需求的同時，還提供了一種螯合鋁的產物——草酸[24]。此外鋁離子還是一種助氧劑，能使細胞內ROS分子顯著增加[25]，為緩解氧化作用，QM7通過OdhA酶的作用提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和α-酮戊二酸清除ROS的能力[26]。然而，如何通過上述反應提高緩解鋁毒的有效率還需進一步實驗研究。

本研究分離得到一株芽孢桿菌QM7，利用茶園土壤盆栽實驗發現菌株QM7對茶樹幼苗的根系有良好的促生作用，從它對鋁離子脅迫的響應推測，QM7是通過加強三羧酸循環和能量代謝途徑緩解鋁的毒害作用。本研究為將來通過調節土壤養分，刺激相關胞內代謝從而進一步提高芽孢桿菌在酸性土壤中的適應能力和相關菌劑在茶樹促生方面的應用奠定研究基礎，但芽孢桿菌是否存在其他途徑來適應酸、鋁脅迫環境，保持其生物活性尚待以后研究。

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Research on The Promoting Effects on Tea Growth and Aluminum Tolerant Mechanism of Bacillus subtilis Strain QM7

LUO Yi, SU Youjian, ZHANG Yongli, XIA Xianjiang, SONG Li, WANG Yejun, LIAO Wangyou*
Tea Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

At present, the biological activities of Bacillus.spp and other microorganisms in the acid teagarden soil are not high, thereby difficult to effectively promote plantgrowth and replace or reduce the usage of chemical fertilizer. In this study, one of Aluminum (Al) tolerance strains, Bacillus subtilis QM7 was isolated from teagarden soil. The auxin (IAA) production of QM7 was influenced by Al concentration (from 85.6mg·L-1to 36.8mg·L-1under 0 to 1mmol·L-1external Al respectively). Results of pot experiment showed that strain QM7 could promote plantgrowth by increasing root surface area by 56.8% and numbers of root tips by 27.3% in 6 weeks. Two-dimensionalgel electrophoresis (2-DE) was used to identify proteins involved in Al toxicity-induced changes. Results showed that more than 64 proteins differentially expressed in response to Al stress, including proteins involved in DNA transcription, protein translation and cell envelope, which reduced thegrowth of Bacillus subtilis.

tea planting soil, aluminum tolerance Bacillus subtilis, auxin (IAA), two-dimensionalgel electrophoresis

S154.3；Q939.1

A

1000-369X（2016）06-567-08

2016-04-07

2016-07-26

國家茶葉產業技術體系土壤肥料崗位項目（CARS-23-07B）、安徽省農業科學院科技創新基金項目（16A0823）、安徽省現代農業茶產業技術體系茶樹栽培崗位項目（2016N1820）。

羅毅，男，助理研究員，博士，主要從事茶園土壤微生物研究。*通訊作者：savetheday@163.com