板栗殼生藥研究及有效成分沒食子酸、綠原酸、蘆丁含量測定

蘇麗娜,王小慶

(曲靖醫學高等專科學校藥學系,云南曲靖 655000)

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板栗殼生藥研究及有效成分沒食子酸、綠原酸、蘆丁含量測定

蘇麗娜,王小慶

(曲靖醫學高等?？茖W校藥學系,云南曲靖 655000)

采用性狀鑒別、組織切片鑒別、粉末鑒別對板栗殼進行生藥研究。建立HPLC法同時測定板栗殼中沒食子酸、綠原酸和蘆丁含量,色譜條件為C18柱,甲醇-0.4%磷酸為流動相梯度洗脫,檢測波長275 nm,流速1 mL/min,柱溫30 ℃。結果表明,板栗殼橫切面、縱切面果皮細胞特點、中果皮的石細胞群和石細胞環帶、內果皮較多的非腺毛、種脊部位的三角形維管束及粉末中果皮細胞、石細胞、非腺毛特征均可作為板栗殼的生藥鑒別特征,為板栗殼生藥學質量標準研究奠定基礎。測定11批云南不同產地板栗殼樣品中沒食子酸含量為0.328～0.362 mg/g,綠原酸含量為0.129～0.141 mg/g,蘆丁含量為0.180～0.230 mg/g。該含量測定方法操作簡單,結果準確,專屬性強,為板栗殼質量標準的建立提供依據。

板栗殼,沒食子酸,綠原酸,蘆丁,高效液相色譜,生藥研究

板栗殼為殼斗科植物板栗(Castanea mollissima Blume)的外果皮,藥性甘、澀、平,具有降逆、止血的功效,主治反胃、鼻衄、便血等癥[1]?，F代藥理研究表明:板栗殼的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇和水提取液具有不同程度的抑菌、抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[2-8],因此板栗殼提取物在醫藥和保健品等領域有廣闊的應用前景。板栗殼主要含有異澤蘭黃素、酚類、黃酮(或其苷類)、有機酸、植物甾醇(或三萜)、內酯、香豆素(或其苷類)、糖、多糖(或苷類)、鞣質等成分[9-12],其中有機酸的主要成分沒食子酸、綠原酸及黃酮類化合物蘆丁均具有抗炎、抗菌、抗突變、抗氧化、抗自由基、抗腫瘤等藥理活性[13-15],對其進行含量測定,對板栗殼藥材質量標準的建立及應用研究有實際意義。

目前已有報道[16-18]板栗殼質量標準的研究,但研究對象主要是板栗總苞。韋琴[19]采用高效液相色譜法和鐵鹽催化比色法測定了板栗殼中原花青素的含量,而沒食子酸、綠原酸和蘆丁的含量測定未見報道。因此本實驗采用反相高效液相色譜法同時測定板栗殼中沒食子酸、綠原酸、蘆丁三種有效成分的含量,并對板栗殼藥材性狀特征,組織切片特征、粉末特征進行生藥學鑒別研究,為板栗殼質量標準的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

11批云南不同產地板栗樣品(見表3) 農貿市場,剔除栗仁,將板栗殼置于潔凈陰涼處備用;沒食子酸對照品 中國食品藥品檢定研究院,純度為89.9%,批號110831-201204;綠原酸對照品 中國食品藥品檢定研究院,純度為96.6%,批號110753-201314;蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,純度為90.5%,批號100080-200904;甲醇和乙腈 色譜純,美國JT.Baker公司;超純水為本實驗室超純水器自制 南京易普易達科技發展有限公司;其他試劑 均為分析純。

1510系列高效液相色譜儀 包括高壓四元泵,在線脫氣機,自動進樣器,PDA二極管陣列檢測器,柱溫箱,美國科學系統;NikonE400數碼一體化顯微鏡系統和NikonDXM1200攝像頭 日本尼康;KQ-250VDB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;MS105DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;DFY-200搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗殼顯微切片和粉末切片的制備 顯微切片:選取適當材料放入丙三醇-50%乙醇(1∶1)溶液中軟化48 h依次轉移到70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇中脫水各3 h后用無水乙醇浸泡兩次使脫水完全,每次10 min。脫水后將材料依次放于正丁醇-無水乙醇(1∶1)1 h、正丁醇-無水乙醇(4∶1)30 min和正丁醇(重復1次)30 min透明。透明后在正丁醇溶液中少量多次加入已熔化的石蠟,待石蠟-正丁醇為1∶1時,倒出混合溶液,加入純石蠟55 ℃浸蠟24～48 h。浸蠟完全后將材料包埋于石蠟中,待完全凝固后切成10～16 μm的切片,將切片放入滴有蒸餾水的干凈載玻片上置于恒溫臺上展片,待切片完全展開用吸水紙吸去蒸餾水置于電熱干燥箱中36 ℃烘片24 h,以二甲苯熔蠟兩次,每次30 min,后依次放入二甲苯-無水乙醇(1∶1)、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各15 min,然后放入0.5%番紅(50%乙醇溶液)中染色24 h后依次放入50%乙醇、70%乙醇中各15 min后,放入0.1%固綠(95%乙醇溶液)中對染5 s,過95%乙醇、無水乙醇(兩次)、二甲苯(兩次)洗去殘留的固綠。切片從二甲苯中取出后直接用中性樹膠封片后數碼攝影顯微鏡觀察,拍照。

粉末切片:藥材粉碎后過40目篩,取少許粉末放于干凈的載玻片上,滴加水合氯醛溶液,于酒精燈外焰處加熱透化,反復透化三次,再滴加稀甘油溶液,封片后數碼攝影顯微鏡觀察細胞形態特征,拍照。

1.2.2 色譜條件 采用反相高效液相色譜法測定沒食子酸、綠原酸和蘆丁的含量。Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);參考文獻[20-24]分別采用乙腈-水,甲醇-水,加入不同比例的冰醋酸或磷酸作流動相,利用等度洗脫或梯度洗脫分離沒食子酸、綠原酸和蘆丁。檢測波長275 nm;流速1 mL/min,柱溫30 ℃,進樣體積10 μL。

1.2.3 對照品溶液的制備 取沒食子酸、綠原酸、蘆丁對照品適量,加甲醇溶解并定容,分別得1.44、1.76、1.35 mg/mL貯備液。量取貯備液適量,加50%甲醇制成對照品混合溶液,其中沒食子酸、綠原酸、蘆丁的質量濃度分別為53.33、65.18、50.00 μg/mL。所有對照溶液制備后避光儲存于4 ℃備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 板栗殼晾干粉碎過200目篩,干燥至恒重。精密稱取板栗殼粉末0.2 g,分別加入極性不同的甲醇、75%甲醇、50%甲醇,95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯和石油醚各30 mL,40 ℃超聲(頻率20 kHz)間歇提取45 min,冷卻,濾過,濾液旋轉蒸發除去提取溶劑,殘渣加適量甲醇溶解定容至25 mL,用0.22 μm有機濾膜過濾,即得。

1.2.5 標準曲線的繪制 精密量取1.2.3項下對照品混合溶液適量,加50%甲醇稀釋使沒食子酸的含量為10.67、5.34、2.66、1.34、0.67、0.34 μg/mL,綠原酸含量為13.04、6.52、3.26、1.63、0.81、0.41 μg/mL,蘆丁含量為10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.32 μg/mL。取10 μL注入高效液相色譜儀進樣后以峰面積為縱坐標,對應的各對照品的濃度為橫坐標,得出各對照品濃度與峰面積的線性關系式。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒別

本品破碎為大小不等的不規則塊片,厚約1 mm。外表面褐色或棕褐色,頂端密被淡黃色絨毛,其余部位絨毛稀疏稍光滑,內表面淡黃色至淡褐色,被密集長絨毛?；诇\棕色,表面粗糙,無絨毛。質堅硬,易折斷,斷面凹凸不平。氣微、味微澀。見圖1。

圖1 板栗殼性狀圖Fig.1 Characters of chestnut epicarp

2.2 顯微鑒別

2.2.1 板栗殼組織切片 板栗殼橫切面:外果皮細胞長圓柱形,淡黃色呈柵狀排列,壁稍厚,外被角質層;中果皮由數列細胞構成,散有小型外韌型維管束;內果皮為一列小方形薄壁細胞。種皮由一列細胞構成,內可見外胚乳。見圖2。板栗殼縱切面:外果皮由一列長方形細胞構成,外被角質層,中果皮層和內果皮層細胞呈黃棕色,多皺縮。見圖3。

圖2 板栗殼橫切面圖Fig.2 Transverse section micrographs of chestnut epicarp注:1角質層,2外果皮,3中果皮,4維管束, 5內果皮,6種皮,7外胚乳。

圖3 板栗殼縱切面圖Fig.3 Longitudinal section micrographs of chestnut epicarp注:1角質層,2外果皮,3中果皮,4內果皮。

2.2.2 板栗殼基底組織切片 板栗殼基底橫切面:外果皮由數列細胞構成,可見草酸鈣簇晶、方晶;外果皮內側,中果皮外側有較多石細胞群,石細胞較大,多為類圓形、不規則形、分枝狀,層紋較明顯,有的可見孔溝。中果皮由十余列薄壁細胞構成,內含棕色色素。中果皮內側有一石細胞環帶,石細胞較小,呈類圓形、類方形和不規則形,層紋和孔溝隱約可見。石細胞環帶的上下兩側,均散在草酸鈣簇晶。內果皮內側有較多非腺毛,種脊部位有維管束。見圖4。板栗殼基底縱切面:外果皮由數列細胞構成。中果皮外側有較多石細胞群及少量小型維管束。石細胞群成類圓形散在,石細胞多為類圓形、不規則形,壁較厚,層紋明顯,有的可見孔溝。石細胞群周圍、維管束及種脊維管束旁可見草酸鈣方晶。內果皮由一列細胞構成,內含棕色色素,可見較多非腺毛。見圖5。

圖4 板栗殼基底橫切面圖Fig.4 Base transverse section micrographs of chestnut epicarp注:1:外果皮,2:石細胞群,3:草酸鈣方晶,4:草酸鈣簇晶, 5:中果皮,6:石細胞帶,7:內果皮,8:非腺毛,9:種脊維管束。

圖5 板栗殼基底縱切面圖Fig.5 Base longitudinal section micrographs of chestnut epicarp注:1:外果皮,2:維管束,3:石細胞群,4:中果皮, 5:內果皮,6:非腺毛,7:種脊維管束。

2.2.3 板栗殼粉末 粉末灰褐色,氣微,味微澀。果皮表皮細胞表面觀呈多角形,壁厚,表面有角質紋線,內含黃棕色物質。中果皮細胞多角形,呈淡黃色。內果皮細胞多為方形,有網狀紋理。胚乳細胞呈黃褐色,含糊粉粒。中果皮外側石細胞極多,較大,呈類圓形、不規則形、分枝狀,壁厚,層紋較明顯,有的可見孔溝及壁孔,大小約為60～100 μm。中果皮內側石細胞較小,呈類圓形、類方形和不規則形,層紋和孔溝隱約可見,大小約為20～50 μm。導管多為螺紋導管,直徑約為18～30 μm。非腺毛為單細胞,長80～400 μm,常彎曲,壁增厚。纖維呈束。草酸鈣方晶直徑約為6～50 μm。草酸鈣簇晶直徑約為15～80 μm。

圖6 板栗殼粉末顯微圖Fig.6 Microscopic images of tissue powder of chestnut epicarp注:1:非腺毛,2:石細胞,3:果皮表皮細胞,4:草酸鈣方晶, 5:胚乳細胞,6:中果皮細胞,7:內果皮細胞, 8:導管,9:果皮纖維,10:草酸鈣簇晶。

2.3 沒食子酸、綠原酸和蘆丁含量測定

2.3.1 樣品處理條件的優化 實驗中選用不同比例的甲醇或乙醇,板栗殼提取液顏色較深,存在大量板栗殼色素,干擾沒食子酸、綠原酸及蘆丁的含量測定,采用石油醚萃取后,效果仍然不佳。用石油醚浸泡后,再用乙酸乙酯超聲提取,能減少色素及其他成分對測定的影響。

因此供試品的制備方法為:精密稱取板栗殼粉末0.2 g,加30 mL石油醚浸泡24 h,棄去石油醚液,藥渣揮干;加30 mL乙酸乙酯,超聲間歇提取45 min,濾過,濾液旋轉蒸發除去乙酸乙酯,殘渣加適量甲醇溶解定容至25 mL,即得。

2.3.2 色譜條件的優化 流動相為乙腈-0.4%磷酸或甲醇-0.4%磷酸,采用梯度洗脫均能將三種成分分離且不受其它成分的干擾。最終確定色譜條件:流動相A(甲醇),流動相B(0.4%磷酸),梯度洗脫,見表1,檢測波長275 nm;流速1 mL/min,柱溫30 ℃,進樣體積10 μL。此色譜條件下所測定各成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離最度均大于1.5,且各色譜峰的對稱性良好,見圖8。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

2.3.3 檢測波長的選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器多波長掃描(見圖7),沒食子酸在220 nm及270 nm處有最大吸收,綠原酸在218 nm及327 nm處有最大吸收,蘆丁在257 nm及350 nm處有最大吸收,分別在各成分的最大紫外吸收附近即254,275,280,290,295,300,310,320 nm波長處進行檢測,在275 nm三種成分檢測靈敏度較好,故本實驗確定檢測波長為275 nm。

圖7 三維光譜圖Fig.7 Three-dimension spectrum注:1.沒食子酸，2.綠原酸，3.蘆丁,圖8同。

圖8 對照品混合液(A)和板栗殼樣品(B)HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Chestnut Epicarp(B)

2.3.4 方法學驗證 線性范圍與專屬性:樣品和對照品的HPLC圖譜見圖8。結果表明,沒食子酸的保留時間約為6.0 min,線性回歸方程為y=501.21x+2762.7,r=0.9998,0.34～10.67 μg/mL范圍內線性關系良好;綠原酸的保留時間約為16.0 min,線性回歸方程為y=357.58x+4018.4,r=0.9997,0.41～13.04 μg/mL范圍內線性關系良好;蘆丁的保留時間約為25.1 min,線性回歸方程為y=1073.9x+2380.6,r=0.9997,0.32～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

表2 加樣回收率測定結果Table 2 Results of recovery tests

表3 樣品測定結果Table 3 Analytical results of ±s)

精密度實驗:精密吸取對照品混合溶液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,每次進樣10 μL,重復進樣6次,測定峰面積,計算沒食子酸峰面積RSD為1.54%,綠原酸峰面積RSD為1.81%,蘆丁峰面積RSD為1.86%,結果表明儀器精密度良好。

重復性實驗:精密吸取2.3.1項下制備的同一批次供試品溶液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,棄去粗濾液,取續濾液,每次進樣10 μL,重復進樣6次,測定峰面積,沒食子酸、綠原酸和蘆丁峰面積RSD分別為1.23%、1.82%、2.35%,結果表明方法重復性良好。

穩定性實驗:精密吸取重復性實驗項下制備的供試品溶液室溫避光放置,分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣,按2.3.2項下色譜條件測定峰面積。沒食子酸、綠原酸、蘆丁的峰面積RSD分別為1.85%、2.02%、1.97%,結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收率實驗:精密稱取6份已知含量的板栗殼粉末0.2 g,分別精密加入對照品混合溶液(每1 mL含沒食子酸、綠原酸和蘆丁1.44、1.76、1.35 mg)0.02 mL,按2.3.1項下制備供試品溶液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,棄去粗濾液,取續濾液,按2.3.2項下色譜條件測定計算回收率。各成分平均回收率分別為91.15%、94.69%、98.59%,RSD%分別為7.99%、7.11%、7.54%,見表2,結果表明各成分加樣回收率良好。

2.3.5 樣品測定 按2.3.1項下制備11批云南不同產地供試品溶液,用0.22 μm微孔濾膜濾過,棄去粗濾液,取續濾液,按2.3.2項下色譜條件可同時測定供試品溶液中沒食子酸、綠原酸和蘆丁的具體含量值,結果見表3。11批云南不同產地板栗殼中沒食子酸含量在0.328～0.362 mg/g,綠原酸含量在0.129～0.141 mg/g,蘆丁含量在0.180～0.230 mg/g。

3 結論

生藥研究實驗結果表明板栗殼的主要顯微鑒別特征為:板栗殼橫切面外果皮細胞長圓柱形,呈柵狀排列。板栗殼基底橫切面中果皮外側有較大石細胞構成的石細胞群,中果皮內側有一石細胞環帶,周圍分布較多的草酸鈣簇晶和方晶;內果皮內側有較多非腺毛,種脊部位有一類三角形維管束。粉末特征中,果皮表皮細胞和中果皮細胞呈多角形,內果皮細胞多為方形,有較多層紋明顯的大型厚壁分枝狀石細胞及層紋和孔溝隱約可見的小型石細胞,非腺毛為厚壁單細胞。本文從板栗殼性狀、組織切片、粉末特征對其做了全面的生藥研究,這些特征在文獻中未見報道,為板栗殼生藥學質量標準研究奠定了基礎。

采用反相HPLC法,梯度洗脫,可同時測定板栗殼樣品中沒食子酸、綠原酸和蘆丁的含量,各成分質量濃度與峰面積在測定范圍內均呈良好的線性關系(r≥0.9997),平均加樣回收率分別為91.15%、94.69%、98.59%,RSD%分別為7.99%、7.11%、7.54%,該方法操作簡單,結果準確,專屬性強,為板栗殼質量標準的建立提供依據

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Pharmacognostical studies of Chestnut Epicarp and determination of active ingredients including gallic acid,chlorogenic acid and rutin

SU Li-na,WANG Xiao-qin

(Department of pharmacy,Qujing Medical College,Qujing 655000,China)

PharmacognosticalstudiesofChestnutEpicarpwerecarriedoutbyusingmorphologicalidentification,tissuesliceidentificationandpowderidentification.Gallicacid,chlorogenicacidandrutinweresimultaneousdeterminedbyHPLCequippedwithHypersilODS2columnandUVdetectionwasused,thedetectionwavelengthwassetat275nm.Themobilephasewasconsisitedofmethanoland0.4%phosphoricacidwithgradientelution.Theflowratewas1.0mL/minandthecolumntemperaturewasat30 ℃.TheresultsshowedthatthesefeaturesintransverseandlongitudinalsectionsofChestnutEpicarp,pericarpcell,stonecellsgroupsandstonecellringofsarcocarp,alargenumberofnon-glandularhairsofendocarpandtriangularvascularbundlelocatedattheraphesitecouldbeusedasChestnutEpicarppharmacognosticalcharacteristics,additionally,thepowdercharacteristicsofpericarpcell,stonecellsandnon-glandularhairswerepharmacognosticalcharacteristicsofChestnutEpicarp,whichlaidthefoundationtofurtherstudypharmacognosticalqualitystandardofchestnutepicarp.Thecontentrangeofgallicacidwas0.328～0.362mg/g,chlorogenicacidwas0.129～0.141mg/g,andrutinwas0.180～0.230mg/ginthechestnutepicarpproducedat11differentplacesinYunnan.Themethodwassimple,accurateandspecific.Itcanprovidebasisfortheestablishmentofqualitystandardofchestnutepicarp.

ChestnutEpicarp;gallicacid;chlorogenicacid;Rutin;HPLC;pharmacognosticalstudies

2016-04-21

蘇麗娜(1980-), 碩士研究生，副教授，研究方向：藥物質量控制及體內藥物分析， E-mail：sulina828@163.com。

云南省教育廳科學研究基金項目(2012Y210)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)21-0323-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.054