磁性石墨烯-液質聯用測定雞肉中萬古霉素和喹諾酮

董彥莉，劉卉閔，李超，馬晶軍，崔曉娜

(1.河北農業大學 理學院，河北 保定 071000；2.山東畜牧獸醫職業學院 食品藥品科技系，山東 濰坊 261061)

?

磁性石墨烯-液質聯用測定雞肉中萬古霉素和喹諾酮

董彥莉1，劉卉閔1，李超1，馬晶軍1，崔曉娜2

(1.河北農業大學 理學院，河北 保定 071000；2.山東畜牧獸醫職業學院 食品藥品科技系，山東 濰坊 261061)

建立了雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留的磁性石墨烯固相萃取-液相色譜-串聯質譜分析方法.樣品采用乙腈提取，磁性石墨烯粉分散固相萃取凈化，經Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm ×100.0 mm，1.8 μm)色譜柱分離，液相色譜-串聯質譜儀進行檢測.目標物在2.0～50.0 μg/L內線性關系良好(r2>0.99).雞肉基質中目標化合物在5、10、25 μg/kg加標水平的回收率為71.2%～98.8%，相對標準偏差(RSD)為6.8%～14.3%.該方法凈化效果好，回收率高，精密度好，可用于雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留檢測.

磁性石墨烯固相萃取(MSPE)；液質聯用法；萬古霉素；喹諾酮類

萬古霉素(vancomycin)是由鏈霉菌產生的、結構復雜的糖肽類抗生素，由于萬古霉素具有嚴重耳毒性及腎毒性[1]，因此只宜在其他抗生素對病菌無效時才會被短期使用于搶救，農業部560號公告規定萬古霉素為禁用獸藥.喹諾酮類(quinolones，QNs)藥物是一類抗菌作用強的人工合成抗菌藥.近年來，該類藥物在動物源性食品中殘留的現象普遍存在，從而危害人類健康.為了對QNs類獸藥殘留實施監控，許多國家紛紛制定出喹諾酮在動物性食品中的限量[2].美國FDA規定了家禽肉中的部分QNs的限量.日本批準使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、達氟沙星、馬波沙星、氧氟沙星和噁喹酸[3].中國農業部發布的235號和236號公告亦對QNs的限量作了規定[4].目前檢測萬古霉素和喹諾酮類藥物的方法很多，包括高效毛細管電泳、高效液相色譜及液質聯用技術等.質譜檢測器具有高靈敏度和選擇性，定性、定量準確，適合進行多組分獸殘的快速檢測.

磁性石墨烯由氧化石墨烯化學制備而成，不僅保持了氧化石墨烯優越的吸附性能，同時具有磁性，能在外加磁場的作用下快速從樣品溶液中分離，因此，非常適合作為固相萃取的吸附劑[4-6].

本文采用實驗室制備磁性石墨烯最常用的共沉淀法(氧化還原法)和溶劑熱法，并進行了綜合改進來進行磁性石墨烯的制備[7-10]，采用制備的磁性石墨烯進行前處理凈化，建立了雞肉中萬古霉素和10種喹諾酮類藥物的液相色譜串聯質譜檢測方法，方法簡便，快速，靈敏度高，重現性好，為打擊獸藥非法添加提供了技術支持.

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 試劑

標準物質萬古霉素、麻保沙星、伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、環丙沙星-D8，均購自DR.公司，純度大于99%.

乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher)；無水硫酸鈉，分析純(煙臺市雙雙化工)；甲酸，色譜純(TEDIA)；水，GB/T 6682規定的一級水；磁性石墨烯，實驗室制備；硫酸銅，優級純(天津市北聯精細化學品開發有限公司)；1-(2-吡咯偶氮)-2-萘酚(PAN)，分析純(北京化學試劑有限公司).

1.1.2 儀器

液相色譜質譜聯用儀(Agilent1290-6460)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g各1臺；離心機(5810型、Eppendorf公司)；均質器(T25型，IKA公司)；振蕩器(MMV-1000 W，ETELA公司)；氮吹儀(N-EVAP)；渦流混勻器(IKA MS basic).

1.1.3 標準溶液配制

萬古霉素、麻保沙星、伊諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、雙氟沙星、沙拉沙星：用乙腈溶解，按純度標示折算配制成100 μg/mL的標準儲備液.

環丙沙星-D8(內標): 用乙腈溶解，按純度標示折算配制成100 μg/mL的標準儲備液.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取

準確稱取(2.00±0.02)g待測雞肉樣品置于50 mL離心管中，加入2 g氯化鈉(NaCl)和10 mL乙腈，均質2 min，10 000 r/min離心10 min，待凈化.

1.2.2 樣品凈化

稱取10 mg磁性石墨烯于10 mL離心管中，取6 mL上清液(1.2.1)入離心管中，置于振蕩器上振蕩2 min.用磁鐵將磁性石墨烯聚集到離心管底部，將上清液轉入5 mL離心管中，氮氣吹干，流動相定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，進行HPLC-MS/MS測定分析.

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min，進樣量：20 μL；流動相(體積分數)：A.0.1%甲酸水，B.乙腈，梯度洗脫程序(體積分數)：0→3.0 min，由10%B→30%B；3.0→5 min，由30%B→70%B；5.0→7.0 min，由70%B→90%B；7.01 min，10%B，平衡3 min.

1.2.4 質譜條件

電離方式：ESI+；掃描方式：多反應監測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；噴霧針壓力：0.2758 MPa；電子倍增器電壓：4 000 V；碰撞氣：高純氮，99.999%，12種化合物質譜參數見表1.

表1 12種化合物的質譜參數

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

喹諾酮類藥物在極性方面相近，色譜分離方面要盡可能選擇合適的色譜柱，以提高色譜柱分離速度和靈敏度，在色譜柱的選擇性方面，選用粒徑1.8 μm填料的色譜柱，分別比較Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 系列1.8 μm填料，柱長分別為2.1 mm×50 mm、2.1 mm×100 mm、3.0 mm×100 mm，以及C18與C8(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)2種相同規格，不同性質的色譜柱，綜合比較了分離效率、靈敏度，柱長為3.0 mm×100 mm C18更好一些.同時選用1.8 μm的填料，使得柱體單位體積內的表面積大大增加，柱效顯著提高，使用0.3 mL/min的柱流速與電噴霧離子化方式所要求的流速具有良好的匹配.

2.1.2 流動相的選擇

2.1.2.1 流動相組分的選擇

為獲得最佳的分辨率和靈敏度，分別選用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%(體積分數)甲酸水溶液、乙腈/0.1%(體積分數)甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸銨、甲醇/10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，在電噴霧源ESI+方式下，在乙腈/0.1%(體積分數)甲酸水溶液組成的流動相中，質譜的離子化效率優于其他試劑，因此本文選擇乙腈/0.1%(體積分數)甲酸水作為流動相.

2.1.2.2 梯度洗脫條件的選擇

分別將初始流動相比例調整為40∶60、30∶70、20∶80、10∶90，經多次進樣分離結果表明：初始流動相中有機相的體積分數占10%，梯度變化有機相漸變，目標物峰形較好，分離時間較短，梯度變化過快會導致麻保沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、環丙沙星出峰出現重疊.在本文的梯度洗脫條件下，12種化合物的出峰情況見圖1.

圖1 12種化合物的總離子流譜圖Fig. 1 Chromatogram of vancomycin and quinolones

2.2 質譜條件的選擇

萬古霉素屬于糖肽類大分子抗生素，通常以鹽酸鹽形式存在，極性較強.分別在正離子模式和負離子模式下進行質譜離子優化，發現在正離子模式下響應值較高，流動相中加入甲酸后質譜離子化效率更佳.萬古霉素分子質量為1 449.263 5，因其帶雙電荷，母離子掃描在正離子模式下724.9響應較高，符合解離規律.子離子掃描時分別在100～1 000、1 000～1 500內進行，發現m/z144.1，m/z1 143.9響應較高，如圖2所示.

圖2 分別在100～1 000、1 000～1 500內子離子掃描圖Fig. 2 Daughter scan in 100～1 000 and 1 000～1 500

2.3 方法的線性、精密度、檢測限和定量限

按照本方法所確定的實驗條件，分別在空白雞肉樣品中添加質量濃度為2.0～50 μg/L的標準溶液，其峰面積Y與對應的質量濃度X(μg/L)在此范圍內呈現良好的線性關系，2種凈化方法的相關系數如表2所示.按10/1的信噪比計算最低定量限，按3/1的信噪比計算萬古霉素的檢出限(LOQ)為0.050 mg/kg，喹諾酮類物質的最低檢出限(LOQ)為0.005 mg/kg.

表2 雞肉中萬古霉素和喹諾酮類物質的回歸方程、相關系數、回收率和變異系數

2.4 磁性石墨烯前處理方法與傳統方法的比較

磁性石墨烯比表面積大，相對于較傳統的QuEChERS方法 C18、PSA、NH2、石墨凈化方法固相萃取凈化技術用量少[11-12]，但凈化效果更佳，能夠實現高通量樣品分析，溶劑消耗少，樣品制備簡便、快捷.比較了同一加標濃度下，采用磁性石墨烯凈化處理，與采用傳統QuEChERS方法凈化的雞肉樣品的HPLC-MS/MS測定結果，如表3所示.

表3 磁性石墨烯與QuEChERS凈化方法比較分析

3 結論

將自制的磁性石墨烯作為前處理凈化材料，建立了雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物殘留的液相色譜-串聯質譜分析方法.磁性石墨烯固相萃取凈化法較傳統QuEChERS方法，具有用量少、凈化效果好、回收率高的優點，使雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物的檢測限和定量限均降低.本文建立的磁性石墨烯固相萃取-液質聯用法測定萬古霉素和10種喹諾酮類藥物殘留方法，簡便，靈敏度高，回收率高，精密度好，適用于雞肉中萬古霉素和喹諾酮類藥物的同時檢測.

[1] 冼燕萍,陳立偉,羅海英,等.UPLC-MS/MS法測定豬肉中萬古霉素和去甲萬古霉素[J].分析測試學報,2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004. XIAN Y P,CHEN L W,LUO H Y,et al.Quantitative determination of vancomycin and norvancomycin in pork by u ltra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004.

[2] ZHENG J，HUANG X R,LI Y P.Determination of remained enrofloxacin in eel by eLISA [J].Food Science,2004，25(10):247-250.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.10.060.

[3] 王柯,王艷艷,趙東保,等.HPLC法測定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J].河南大學學報(自然科學版),2011，41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009. WANG K,WANG Y Y,ZHAO D B,et al.Determination of the contents of luteolin and luteoloside in different parts of lonicera japonica by HPLC[J].Journal of He nan University (Natura1 Science),2011，41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009.

[4] LIU Q,SHI J B,ZENG L X,et al.Evaluation of graphene as an advantageous adsorbent for solid-phase extraction with chlorophenols as model analytes[J].Journal of the Chromatography A，2011,1218(2):197-204.DOI:10.1016/j.chroma.2010.11.022.

[5] LIU Q,SHI J B,SUN J T,et al.Graphene and graphene oxide sheets supported on silica as versatile and high-performance adsorbents for solid-phase extraction[J].Angewandte Chemie International Edition，2011,50(26):5913-5917.DOI:10.1002/anie.201007138.

[6] LUO Y B,SHI Z G,GAO Q,et al.Magnetic retrieval of graphene: Extraction of sulfonamide antibiotics from environmental water samples[J].Journal of Chromatography A，2011，1218:1353-1358. DOI:10.1016/j.chroma.2011.01.022.

[7] HUMMERS W,OFFEMAN R.Preparation of graphite oxide[J].Journal of the American Chemical Society,1958,80(6):1339.DOI:10.1021/ja01539a017.

[8] STAUDENMAIER L.Verfahren zur darstellung der graphitsaure[J].Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft，1898,31(2):1481-1487.DOI:10.1002/cber.18980310237.

[9] BRODIE B C.Surle poids atomique du graphite[J].Annual Review of Physical Chemistry，1860，59: 466-472.

[10] ZHOU Y，BAO Q L,TANG L A L.Hydrothermal dehydration for the green reduction of exfoliated graphene oxide to graphene and demonstration of tunable optical limiting properties[J].Chem Mater,2009,21:2950-2956.DOI:10.1021/cm9006603.

[11] 賈其娜,趙廣超.石墨烯固相微萃取纖維的制備及對多氯聯苯的檢測[J].分析測試學報,2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004. JIA Q N,ZHAO G C.Preparation of graphene-based solid phase microextraction fiber and Its determination of polychlorinated biphenyls[J].Journal of Instrumental Analysis,2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004.

[12] 丁葵英,許文娟,李凱,等.液相色譜-串聯質譜法研究涕滅威及其代謝物在白菜中的動態行為[J].色譜,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018. DING K Y,XU W J,LI K,et al.Dynamic behavior of aidcarb and its metabolites in cabbage by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018.

(責任編輯：梁俊紅)

Determination of vancomycin and QNs residues in chicken by graphene based-MSPE-liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry

DONG Yanli1，LIU Huimin1，LI Chao1，MA Jingjun1，CUI Xiaona2

(1.College of Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.Department of Food and Drug Science and Technology, Shandong Vocational Animal Science and Vetevinary College，Weifang 261061，China)

A method for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken was developed using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).The sample was extracted with acetonitrile and purified using MSPE as the sorbent.The target compounds were separated on a Agilent ZORBAX SB-C18 column (3.0 mm×100 mm，1.8 μm) before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that high correlation coefficients (r2>0.99) of the analyses were obtained within their respective linear ranges.The average recoveries and the relative standard deviations ranged from 71.2% to 98.8% and 6.8% to 14.3% respectively at the spiked levels of 5，10，25 μg/kg in chicken．This method is reliable，and suitable for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken.

graphene MSPE；liquid chromatography mass spectrometry；vancomycin；quinolones

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.006

2015-03-15

河北省科技支撐計劃項目(14227115D)；山東省濰坊市科技支撐計劃項目(2015GX044)

董彥莉(1981—)，女，河北鹿泉人，河北農業大學副教授，主要從事分析化學方面的研究. E-mail:dyl19810314@126.com

O652

A

1000-1565(2016)05-0480-07