干旱脅迫誘發的玉米DNA甲基化變異的研究

于曉明 王霞 黨曉宇

摘要：本實驗以玉米品種B73和H99為實驗材料，分別對其進行干旱脅迫處理（0天、5天、7天、9天、11天），用MSAP方法分析干旱脅迫條件下的玉米基因組DNA甲基化變化情況。結果表明，干旱脅迫下，玉米DNA甲基化修飾發生了明顯的改變，包括甲基化水平變化和模式變化； B73與H99的甲基化變異程度存在差異，其中B73在處理7天時檢測到的變異率最高，為32.48%，H99在處理9天后的變異率最高，為30.00%。本研究初步分析了玉米在干旱脅迫下所發生的表觀遺傳學變異的頻率及其與玉米抗逆性之間可能存在的關系，為進一步研究植物抗干旱脅迫的機制和培育抗干旱玉米新品種提供理論依據。

關鍵詞：玉米；干旱脅迫；DNA甲基化；MSAP

基金項目： 吉林省科技發展計劃項目（20130522062JH）；吉林省教育廳科學技術研究項目（吉教科合字[2012]第475號）

中圖分類號： S513；Q945.78 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.021

1干旱對玉米DNA的影響

我國幅員遼闊，江河湖泊眾多，水資源從總量上講是較豐沛的。但是，由于我國人口基數大，人均淡水量僅為世界平均水平的28.1%，位于世界第88位[1]。我國耕地主要分布于華北、東北、華東和中南4個區域，這4個區域的土地占全國土地面積的43.5%，但耕地面積卻占71.7%；西南、西北2個區域的耕地僅占全國耕地面積的28.3%[1]。近些年來，環境惡化、自然災害嚴重、雨水資源分布不均、耕地面積縮減，都對我國糧食安全產生造成嚴重威脅。玉米是各種農作物中能量貯藏最多的種類之一，因而玉米是重要的糧食、飼料以及能量來源。中國的玉米的種植總面積和總產量均居世界第二，未來氣候對我國的玉米產量造成嚴重影響[2]。因此，玉米的單位產量及總產量持續提高對我國糧食安全有重大意義。據有關數據顯示，世界上干旱和半干旱地區占陸地面積的比例達到34.9%，我國干旱及半干旱地區占國土面積的比例高達52%，每年受旱面積達200～270余萬畝。

DNA甲基化（DNA methylation）是指由DNA甲基轉移酶作為催化劑，在S-腺普甲硫氨酸提供甲基供體的基礎上完成催化反應，產生出具有甲基的N-甲基腺嘌呤、N-甲基胞嘧啶和C一甲基胞嘧啶[3]。在真核生物中，DNA甲基化主要以5-甲基胞嘧啶的形式存在[4]。根據已有報道顯示，多種因素可以誘導嘧啶的甲基化。例如植物的轉基因方法能夠導致其本身及基因組中同源序列出現甲基化，從而產生基因沉默現象[5]；植物組織離體培養也能誘導甲基化變異的出現，這種現象是體細胞克隆發生變異的主要原因[6]；在哺乳動物中進行種間雜交和水稻不同品系間雜交均可產生大量胞嘧啶甲基化[7，8]。

雖然通過對模式生物尤其是對擬南芥的研究， 已經初步探明植物DNA甲基化產生和維持的機制以及在模式生物生命活動中的生物學功能[9]， 但是目前對DNA甲基化對農作物的影響研究還不夠深入[10]。本實驗通過對玉米進行干旱處理，研究干旱與DNA甲基化之間的聯系，從而為利用DNA甲基化多態性進行作物改良或去除脅迫印跡來提高作物的抗逆性提供理論基礎，對提高玉米產量具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

玉米品種B73和H99，經不同時間（0天、5天、7天、9天、11天）的250mM甘露醇（干旱）脅迫處理。

2.2 試驗方法

2.2.1 玉米干重測量 在玉米發芽15天后（V3期），分別稱取正常條件下和經5天、7天、9天、11天干旱處理過（250 mM甘露醇模擬干旱脅迫）的玉米全株各20株，干燥箱烘干至恒重，稱量干重。

2.2.2 玉米DNA甲基化敏感擴增多態性（MSAP）分析 提取玉米基因組DNA，進行MSAP分析，包括：限制性酶切、連接、預擴增和選擇性擴增（MSAP實驗方法與體系主要參照羅洋的研究[11]）。選擇性擴增產物送交長春華大中天生物技術有限公司進行毛細管電泳和熒光信號讀取。統計MSAP擴增條帶，信號值大于80時認為有條帶記錄為1，小于80時認為沒有條帶記錄為0。

3 結果分析與討論

3.1 玉米干重分析

如圖1所示，B73和H99在干旱脅迫處理后，干重顯著下降。而且H99干重下降的程度比B73更大。B73干旱脅迫處理5天、7天、9天、11天后的干重分別為0.715、0.663、0.617、0.283；H99干旱脅迫處理5天、7天、9天、11天后的干重分別為0.846、0.756、0.676、0.400。干旱脅迫處理11天時B73和H99均降為最低。表明B73對干旱脅迫比H99更耐受。

圖1 玉米H99和B73干旱處理后的干重

3.2 干旱誘導的玉米DNA甲基化水平變異

如圖2所示，通過對擴增條帶的統計并比較，可以發現B73和H99在干旱脅迫處理后DNA甲基化情況都發生了明顯的變化。其中，B73正常條件下的CG甲基化水平為15.33%，干旱脅迫處理后CG甲基化水平呈略微下降趨勢；而H99與之相反，正常條件下CG甲基化水平為11.42%，干旱脅迫處理后CG甲基化水平呈略微上升趨勢。B73正常條件下CHG甲基化水平為16.27%，干旱處理后CHG甲基化水平呈先下降后在第11天時明顯上升；H99則是先下降后呈略微上升趨勢。上述結果表明，兩個玉米品種B73和H99的在應答干旱脅迫過程中甲基化水平都發生了改變，但是二者甲基化水平變化的方式各不相同，暗示著不同玉米基因型中的甲基化背景對玉米應答干旱脅迫中的甲基化水平變化是有影響的。

圖2 甲基化整體水平變異情況

注：B73-1，B73-2，B73-3，B73-4，B73-5分別為B73干旱處理0天，5天，7天，9天，11天；

H99-1，H99-2，H99-3，H99-4，H99-5分別為H99干旱處理0天，5天，7天，9天，11天。

3.3 DNA甲基化模式變異條帶統計分析

根據MSAP分析條帶表明，B73和H99經干旱處理后的CG和CHG位點均發生了DNA甲基化模式的變異，且二者的甲基化模式變異頻率存在差異。B73處理中B73-2的DNA甲基化條帶數為973，占總甲基化的29.48%；B73-3的甲基化條帶數為1072，占32.48%；B73-4甲基化條帶數為915，占27.73%；B73-5甲基化條帶數為1015，占30.76%。H99處理中H99-2甲基化條帶數為826，占總甲基化的25.03%；H99-3甲基化條帶數為838，占25.39%；H99-4甲基化條帶數為990，占30.00%；H99-5甲基化條帶數為863，占26.15%。

如圖3所示，B73的干旱處理中5天、7天、9天主要以CG去甲基化變異為主，而處理11天時的CG和CHG位點的去甲基化和超甲基化模式變異率相差不大。H99各個處理主要以CHG去甲基化變異為主，且變異率成遞增趨勢。B73在處理7天時的甲基化模式變異率最高32.48%，而H99是在處理9天時的甲基化模式變異率最高30.00%。B73干旱處理后CG超甲基化呈先上升后下降趨勢，CHG去甲基化呈下降趨勢，但CG去甲基化和CHG超甲基化變化無規律；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趨勢，CHG去甲基化成上升趨勢，但CG吵架計劃和去甲基化無規律；B73和H99的both超甲基化和both去甲基化基本無變化。

圖3 甲基化模式變異情況

注：CG hyper：CG超甲基化，CG hypo：CG去甲基化，CHG hyper：CHG超甲基化，CHG hypo：CHG去甲基化，both hyper：both超甲基化，both hypo：both超甲基化。

3.4 討論

逆境脅迫下會導影響基因的表達，進而大致DNA甲基化的變化。本實驗通過MSAP分析方法對比兩種不同品種玉米的DNA甲基化變異情況，發現干旱脅迫下兩種玉米均發生了不同程度的甲基化變異。兩種玉米的CG和CHG位點同時甲基化程度變異基本無變化。在甲基化模式變異中，B73的CG超甲基化呈先上升后下降趨勢，CHG去甲基化呈逐漸降低趨勢；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趨勢，CHG去甲基化成呈逐漸遞增趨勢。B73主要以CG位點去甲基化為主，H99主要以CG位點超甲基化和CHG位點去甲基化為主。B73在干旱處理7天時CG去甲基化和超甲基化程度均達到最高分別為10.09%和6.91%，CHG去甲基化程度隨著干旱處理時間的增加而降低。H99的CHG去甲基化程度在逐漸升高，CG位點甲基化升降趨勢不同。B73在處理7天后的甲基化模式變異率最高32.48%，而H99是在處理9天后的甲基化模式變異率最高30.00%。但這些變化導致了哪個基因或是哪些基因的表達，影響了基因表達過程中的哪一步還不清楚，還需進一步研究。

參考文獻

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通訊作者：于曉明，吉林農業科技學院，講師，研究方向：分子生物學與基因工程。