新疆吐魯番地區三種甜瓜病毒病的發生與分子鑒定

韓盛，韓成貴，玉山江·麥麥提，楊軍，楊渡

(1. 新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 國家農業生物技術重點實驗室/中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193；3. 新疆葡萄瓜果開發研究中心 新疆鄯善 838201)

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新疆吐魯番地區三種甜瓜病毒病的發生與分子鑒定

韓盛1，韓成貴2，玉山江·麥麥提1，楊軍3，楊渡1

(1. 新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 國家農業生物技術重點實驗室/中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193；3. 新疆葡萄瓜果開發研究中心 新疆鄯善 838201)

【目的】明確吐魯番地區西瓜花葉病毒(WMV)、小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)、南瓜蚜傳黃化病毒(CABYV)的發生情況及三種病毒不同來源分離物間的遺傳差異。【方法】采用分子檢測方法，確定吐魯番地區甜瓜CABYV、WMV、ZYMV的侵染比例，應用序列比對及構建系統發育樹分析三種病毒，吐魯番分離物與國內外其他分離物間遺傳差異。【結果】吐魯番地區40份病毒病樣中WMV、ZYMV、CABYV分子檢測陽性比例分別達87.5%、50%、30%。ZYMV吐魯番分離物等部分國內外分離物NIB與CP蛋白之間存在蛋白切割位點Q/S， WMV、ZYMV吐魯番分離物等部分國內外分離物DAG基序的氨基酸序列均為DAG。依據系統發育樹分析將三種病毒吐魯番分離物分別劃分至不同的亞組。 【結論】WMV、ZYMV為吐魯番地區甜瓜病毒病的優勢毒原，CABYV為吐魯番地區甜瓜病毒病的主要病毒之一。CABYV、WMV吐魯番分離物與國內部分省份分離物親緣關系更近，ZYMV吐魯番分離物XJturufan2與東歐、中東國家的分離物親緣關系更近， ZYMV吐魯番分離物XJturufan與國內部分省份分離物及美國、西班牙、日本等國分離物親緣關系更近。

西瓜花葉病毒；小西葫蘆黃化花葉病毒；南瓜蚜傳黃化病毒；系統發育樹；DAG基序

0 引 言

【研究意義】新疆獨特的地理位置以及氣候特征，使其成為國內重要的甜瓜生產基地。近年來，新疆甜瓜種植面積逐年擴大，自2007年以來種植面積即穩定在6×104hm2以上， 2007～2014年種植面積達6.28×104～8.67×104hm2，2009年達峰值8.67×104hm2[1]。隨著新疆甜瓜種植面積不斷增大，甜瓜產量日益增加，新疆甜瓜產業已成為新疆農業生產重要經濟增長點。而病毒病一直是影響新疆甜瓜種植的重要病害，受病毒病侵染的甜瓜植株會出現葉片畸形、花葉、黃化等多種癥狀，最終導致甜瓜果實品質嚴重下降、產量大大降低，病重年份部分甜瓜種植區甚至面臨絕收的境況。2007～2015年，受環境氣候影響，新疆南北疆各主要甜瓜種植區甜瓜作物上病毒病發病嚴重，分別于2007、2013、2014年在不同甜瓜種植主產區發生病毒病暴發流行，其中2014年6～8月期間新疆吐魯番地區0.066 7×104hm2(1萬多畝)復播甜瓜因病毒病暴發流行而毀種。研究分析吐魯番地區甜瓜病毒病流行區致病病毒種類，對于根據不同致病病毒的流行、傳播特性制定合適的防治策略具有重要意義。【前人研究進展】20世紀80年代，國內許多學者對新疆侵染瓜類作物的病毒采用生物學、血清學及電鏡觀察相結合的方法進行了研究鑒定，認為當時新疆侵染哈密瓜的病毒主要有西瓜花葉病毒2號(WMV-2，即PRSV-W),黃瓜花葉病毒(CMV)、南瓜花葉病毒(SqMV),煙草壞死病毒(TNV), 甜瓜葉脈壞死病毒(MVNV)，哈密瓜葉脈壞死病毒(HmVNV)，哈密瓜花葉病病毒(HMMV)，但優勢病毒為WMV-2(即PRSV-W)，CMV和SqMV[2-13]。1991年魏寧生等[14]對新疆、甘肅兩省(區)厚皮甜瓜病毒病樣進行鑒定認為兩地病毒種類有CMV、WMV和SqMV，其中WMV是優勢病毒。1991年鄭光宇等[15]報道了小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)在新疆瓜類作物上的侵染發生，隨后，趙榮樂等[16]和劉衛榮等[17]分別于1998年、2008年對新疆不同瓜類作物ZYMV分離物進行了研究報道。2004年趙榮樂等[18]對侵染新疆甜瓜的SqMV分離物的部分生物學特性進行了研究。2008年，劉衛榮等[19]對從新疆南瓜病樣上分離得到的WMV-2(即PRSV-W)新疆昌吉分離物的CP基因序列進行了研究分析。【本研究切入點】課題組前期研究確定了新疆喀什地區大面積暴發流行的甜瓜"黃葉病"病原主要為CABYV(該研究結果由中國農業大學韓成貴教授合作研究證實)，研究證實了新疆喀什地區大面積暴發流行的甜瓜“黃葉病”病原主要為CABYV，吐魯番產區CABYV的發生情況尚不明確。此外吐魯番地區WMV、ZYMV等Potyvirus屬主要瓜類作物病毒的發生情況及侵染比例也不清楚。研究調查吐魯番地區表現明顯黃化癥狀或畸形、花葉癥狀的甜瓜病毒病發生情況，同時采集相關病樣，采用分子鑒定的方法檢測Polerovirus屬病毒CABYV及Potyvirus屬WMV、ZYMV的侵染情況，并分析相關病毒不同分離物間的遺傳差異。【擬解決的關鍵問題】確定吐魯番地區WMV、ZYMV、CABYV等病毒的侵染情況，初步確定WMV、ZYMV、CABYV等病毒吐魯番分離物與國內外其他分離物間的遺傳差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 毒 源

2014年分別由吐魯番地區鄯善縣魯克沁鎮沙坎爾鄉、沙坎爾農場、吐峪溝鄉、迪卡爾鄉、哈密瓜研究中心采集表現明顯黃化癥狀或畸形、花葉癥狀的甜瓜植株葉片，-20℃保存備用。

1.1.2 載體與菌株

MMLV反轉錄酶購自PROMEGA公司，pEASY-T1 Cloning Kit和Trans10 Chemically Competent Cell 均購自全式金公司。

1.1.3 酶及化學試劑

M-MLV反轉錄酶購自Promega公司；TaqDNA聚合酶、2×EasyTaqPCR SuperMix (購自北京全式金公司)；RNase抑制劑(Ribonuclease Inhibitor,RRI)、T4DNA ligase、pMD19-TVector Ligation Kit購自TAKARA公司， Agarose Gel DNA Purification Kit購自AXYGEN公司；其它化學試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 植物總RNA的提取

取樣品液氮研磨后，先加入800 μL水飽和酚，再加入830 μL RNA buffer于2.0 mL EP管中；劇烈震蕩混勻后，靜置一會于離心機上12 000 r/m離心10 min，取上清600 μL于新管中，加等體積的水飽和酚，上下顛倒輕柔混勻靜置后，12 200 r/m離心15 min；取上清300 μL于新管中，加入等體積的4MliCL,輕柔混勻后-20℃沉淀1 h(注意此步最好使用新滅的槍頭和EP管)； 4℃離心機12 000 r/m離心15 min；棄上清，加70%無水乙醇1 000 μL，洗2次(每洗一次后12 000 r/m離心3 min，棄上清), 第二次洗后空轉一次，吸出廢液；置于37℃吹干，約7～8 min；加入30 μL ddH2O。

1.2.2 RT-PCR擴增目的片段

RT體系：在30 μL RT反應體系中加入8.5 μL DEPC水、6 μL 5×反轉錄酶Buffer、3 μL d NTPs(5 mmol/l)、1 μL M-MLV反轉錄酶(200 U/μL)、0.5 μL RNase抑制劑(40 U/μL)、Polerovirus屬病毒與Potyvirus屬病毒通用反向引物PococpR(-)和M4T(-)各3.0 μL(0.1 ug/ul)，6 μL植物總RNA提取液，于42℃反轉錄60 min，70℃ 變性10 min，4℃保持。

PCR體系：25 μL PCR擴增反應體系中加入8.5 μL ddH2O、2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、1 μL(10 umol/L)正向引物、1 μL(10 umol/L)反向引物、2 μL反轉錄產物，反應擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表2

表1 不同病毒分子檢測使用的引物序列及目標基因
Table 1 Primer sequences and target genes for detection of different viruses

引物名稱及序列Primernameandsequences目標基因Targetgenes目標片段大小Sizeoftargetgene(bp)M4T:5'GTTTTCCCAGTCACGAC(T)153'Potyvirus屬病毒反向通用引物[20]PCCOCPR:5'CGTCTACCTATTTSGGRTTN3'PCCONF: 5'TGYTCYGGTTTTGACTGG3'Polerovirus屬病毒CP基因,參考自尚巧霞博士論文引物序列[21]1300WMV1F:5'-ACGTAGCAAAGAACAGACAAA-3'WMV1R:5'-ACATAAACAGTACGAAGGTGA-3'WMVCP基因序列參考自何丹論文引物序列[22]1300ZYMV1F5'-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'ZYMV1R5'-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3'ZYMVCP基因序列參考自李繼洋論文引物序列[23]596ZYMVF:5’AGCTCCATACATAGCTGAGACAG3’ZYMVR:5’GCTTGCAAACGGAGTC3'ZYMV NIB-CP基因參考自劉衛榮等文獻引物序列[17]1100WMVF:5’GGTTGCTGYGARTCAGTGTC3'(注Y=C/T,R=A/G)WMVR:5’CGACCCGAAATGCTAACT3'WMV CP基因參考自劉衛榮等文獻引物序列[19]1000

表2 不同目標片段的PCR擴增反應程序
Table 2 PCR amplification reaction procedure for different target segments

目標片段TargetsegmentsPCR反應程序PCRamplificationreactionprocedureWMV、ZYMV94℃預變性4min,94℃變性30s,53℃退火45s,72℃延伸1min30s,35個循環,最后72℃延伸10min,4℃保持。Polerovirus屬病毒VirusesbelongstoPolerovirusgenus95℃預變性4min,95℃變性30s,52℃退火45s,72℃延伸1min30s,35個循環,最后72℃延伸10min,4℃保持。

1.2.3 DNA片段的回收純化

采用試劑盒法-AxyPrepTM DNAgel extraction kit(Axygen biosciences)

參照試劑盒使用說明。將切下的凝膠稱重，加入3倍體積(質量體積比)的溶膠緩沖液A，75℃加熱約10 min至膠完全融化，加入緩沖液A1/2體積的緩沖液B，混勻轉移至回收柱中，12 000 r/min離心1 min；棄溶液，在柱中加入500 μL洗滌緩沖液W1，12 000 r/min離心洗滌30s；棄溶液，在柱中加入700 μL洗滌緩沖液W2，12 000 r/min離心洗滌30s，再加700 μL洗滌緩沖液W2，12 000 r/min離心1 min，棄溶液，12 000 r/min離心1 min；之后再12 000 r/min離心1.5 min，回收柱放入新的1.5 mL離心管中，加入25～30 μL預熱至65℃的dd H2O或TE，室溫靜置1 min，12 000 r/min，離心1.5 min，得到回收片段。

1.2.4 目的片段與載體質粒的連接

使用全式金Peasy-T1 Cloning kit，PCR 純化產物4 μL，Peasy-T1 Cloning Vector 1 μL，輕輕混合，干式恒溫儀中25℃ 反應15 min，可放于-20℃備用。

1.2.5 大腸桿菌感受態細胞的轉化

參照全式金Peasy-T1 Cloning kit方法進行。加連接產物(最多5 μL)于50 μL Trans1-T1感受態細胞中(在感受態細胞剛剛解凍時加入連接產物)，輕彈混勻，冰浴20～30 min；42℃熱激30s，立即置冰上2 min；加入250 μL平衡至室溫的SOC或 LB液體培養基，200RPM，37℃1 h；取8 μL 500 mMIPTG和40 μL 20 mg/mL X-gal 混合，涂于LB固體平板(含50 μg/mL的Amp或Kan)，37℃培養30 min；待IPTG 和X-gal被吸收后，取全部300 μL菌液4 000 r/min離心1 min，棄部分上清，保留150 μL，輕彈懸浮菌體，將剩余全部菌液涂板，37℃培養過夜。

1.2.6 重組質粒的菌落PCR鑒定

用滅菌的牙簽挑單菌落于LB固體平板(含50 μg/mL的Amp)上劃線后，挑少許菌落涂布于200 μL PCR管的底部。在上述離心管中加入25 μL在PCR擴增反應體系，8.5 μL ddH2O、2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、1 μL(10 μmol/L)正向引物M13F、1 μL(10 μmol/L)反向引物M13R、2 μL反轉錄產物。擴增條件為：94℃預變性4 min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2 min，35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保持。復性溫度根據所用引物的Tm值確定，延伸時間根據所擴增片段的長度確定(1 kb/min)，反應擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 序列測定和分析比較

挑取陽性克隆的菌種接到2 mL LB(含50 μg/mL Amp)液體培養基中，于搖床中37 ℃150 r/min振蕩培養過夜。取1.5 mL菌液送交北京英俊科技有限公司進行序列測定。在NCBI上進行序列相似性檢索獲得國內外已報道的相關序列比對結果，并利用DNAMAN、MEGA6.0等序列分析軟件分析比較，同時應用MEGA6.06軟件采用近鄰分析法依據各病毒具有一定代表性的不同地區或寄主來源分離物間CP或NIB-CP基因核苷酸序列構建系統發育樹，分析各病毒不同分離物間的遺傳進化關系。

2 結果與分析

2.1 吐魯番鄯善縣甜瓜病毒病發生情況

2014年6月中旬后，吐魯番地區0.066 7×104hm2(1萬多畝)秋茬復播甜瓜病毒病逐漸加重，7月中上旬達發病高峰，大部分地塊因病毒病嚴重發生而毀種。于7月16日和8月21日調查鄯善縣魯克沁鎮沙坎爾鄉、沙坎爾農場、吐峪溝鄉、迪卡爾鄉、哈密瓜研究中心等地調查發現，當地主要有黃化類型及畸形、花葉類型兩種類型病毒病發生。畸形、花葉類型病毒病發生最為普遍，凡是發生病毒病的地塊該類型病毒病均有發生，黃化類型病毒病發生程度僅次于畸形、花葉類型病毒病，但部分地塊僅有畸形、花葉類型而無黃化類型病毒病發生，而畸形、花葉類型與黃化類型病毒病均有發生的地塊大部分病株兩種癥狀同時存在，表明多數病株為復合侵染。

播種時間與病毒病發病程度具有一定相關性，研究中調查的 6月10～25日復播的甜瓜畸形花葉類型病毒病發病率為87%～100%，平均發病率96.17%，黃化類型病毒病發病率0～100%，平均發病率62%，7月1～24日復播甜瓜畸形花葉類型病毒病發病率為0～75%，平均發病率12.22%，黃化類型病毒病發病率0～8%，平均發病率2.11%，整體來看，6月復播甜瓜發病程度明顯重于7月復播甜瓜，發病程度與播種時間存在播種越晚發病程度越輕的趨勢。 表3

2.2 黃化類型病樣及畸形花葉類型病樣的分子檢測結果

應用WMV、ZYMV特異性引物及Polerovirus屬病毒通用引物分別檢測吐魯番鄯善地區29份畸形、花葉類型病毒病樣和11份黃化類型病樣， 畸形、花葉類型病毒病樣和黃化類型病樣均能檢測到WMV、ZYMV及Polerovirus屬病毒，并且部分樣品存在多種病毒復合侵染情況。 圖1～5，表4

供試29份畸形、花葉類型病毒病樣中25個病樣WMV檢測陽性、2個病樣CABYV檢測陽性、10個病樣ZYMV檢測陽性，以病毒復合侵染樣本統計所有供試樣品中2個病樣為WMV、ZYMV、CABYV復合侵染，7個病樣為WMV、ZYMV復合侵染。供試11份黃化類型病毒病樣中，含有WMV、ZYMV、CABYV侵染的病樣均為10份，并且9個樣本WMV、CABYV復合侵染數為，9個樣本為ZYMV、CABYV復合侵染，8個樣本為WMV、ZYMV、CABYV復合侵染。表4

表3 吐魯番鄯善縣甜瓜病毒病發生情況
Table 3 the occurrence of melon virus disease in Shanshan county, Turpan city

地點Place調查時間Surveytime(M/D)黃化類型病毒病發病率Theincidenceofyellowtypevirusdisease(%)畸形花葉類型病毒病發病率Theincidenceofmalformationmosaictypevirusdisease(%)播種時間Sowingdate(M/D)魯克沁鎮殺坎爾鄉Skanrcountry,Lukeqintown7/16901006/20魯吐峪溝鄉楊海村Yanghaivillage,Tuyugoucountry7/160926/20哈密瓜研究中心品種試驗地VarietytestfieldinHamimelonresearchcenter7/161001006/25哈密瓜研究中心試驗地TestfieldinHamimelonresearchcenter7/1682876/25哈密瓜研究中心試驗地TestfieldinHamimelonresearchcenter7/160986/25魯克沁鎮迪卡爾鄉Dekarcountry,Lukeqintown8/211001006/10沙坎爾農場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/214177/1魯吐峪溝鄉Tuyugoucountry8/21277/4沙坎爾農場Sakanrfarm8/218757/5魯吐峪溝鄉Tuyugoucountry8/21127/14沙坎爾農場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21日347/15沙坎爾農場Sakanrfarm8/21007/15魯吐峪溝鄉Tuyugoucountry8/21127/15移栽沙坎爾農場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21007/20沙坎爾農場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21037/24平均發病率(%)Averageincidence(%)26.0745.8

1～11：Polerovirus屬病毒檢測結果，目標基因片段1 300 bp左右；M：DNA分子量標準

1-11:Polerovirusvirus detection results,the length of target fragment is 1,300 bp.M:DNA molecule marker

圖1 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣Polerovirus屬病毒分子檢測結果

Fig. 1 The molecule detection results ofPolerovirusvirus from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

圖2 鄯善縣甜瓜部分畸形、花葉類型病樣Polerovirus屬病毒檢測結果

Fig.2 The molecule detection results ofPolerovirusvirus from melon virus samples with deformity mosaic symptom in Shanshan County

1～11：WMV擴增結果，目標基因片段1 000 bp (WMVF/WMVR引物對擴增)；M：DNA分子量標準

1-11:WMV detection results,the length of target fragment is 1,000 bp(Amplified gene by ZYMVF/ZYMVR primer).M:DNA molecule marker

圖3 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣WMV分子檢測結果
Fig.3 The molecule detection results of wmv from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

1～11： ZYMV擴增結果，目標基因片段約1 100 bp (ZYMVF/ZYMVR引物對擴增);M：DNA分子量標準

1-11:ZYMV detection results,the length of target fragment is 1,100 bp(Amplified gene by ZYMVF/ZYMVR primer).M:DNA molecule marker

圖4 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣ZYMV分子檢測結果

Fig.4 The molecule detection results of ZYMV from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

1～29號為WMV檢測結果，目標片段1 300 bp左右(WMV1F/WMV1R引物對擴增)；30～58號為ZYMV檢測結果，目標片段596 bp左右(ZYMV1F/ZYMV1R引物對擴增)

1-29: WMV detection results, the length of target fragment is 1,300 bp(Amplified gene by WMV1F/WMV1R primer); 30-58:ZYMV detection results, the length of target fragment is 596 bp (Amplified gene by ZYMV1F/ZYMV1R primer)

圖5 鄯善縣甜瓜部分畸形、花葉類型病樣 WMV和ZYMV 檢測結果
Fig.5 The molecule detection results of WMV and ZYMV from melon virus samples with deformity mosaic symptom in Shanshan County

2.3 WMV、ZYMV、CABYV測序結果

將鄯善縣病樣以WMV、ZYMV兩種病毒特異性引物及Polerovirus屬病毒通用引物擴增得到的PCR產物經回收純化克隆后以菌液送交上海英俊公司測序,測序結果在GENEBANK數據庫中進行BLAST比對, WMV新疆鄯善分離物(暫命名為XJturufan和XJturufan2)與WMV新疆SO3-21分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KP406644) 同源性達100%。ZYMV新疆鄯善分離物(暫命名為XJturufan和XJturufan2)與ZYMV斯洛文尼亞SE04T分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KF976713)同源性達99%。CABYV新疆分離物(暫命名為XJturufan)與CABYV韓國HS1分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KR231952 )同源性達98%。測序結果表明經PCR擴增得到了PCR產物分別為WMV、ZYMV、CABYV對應基因序列，證明供試病樣分別為WMV、ZYMV、CABYV侵染。

2.4 兩種類型病樣不同病毒的侵染比例

供試29份畸形、花葉類型病毒病樣中25個病樣WMV檢測陽性、2個病樣CABYV檢測陽性、10個病樣ZYMV檢測陽性，以病毒復合侵染樣本統計所有供試樣品中2個病樣為WMV、ZYMV、CABYV復合侵染，7個病樣為WMV、ZYMV復合侵染。供試11份黃化類型病毒病樣中，含有WMV、ZYMV、CABYV侵染的病樣均為10份，并且9個樣本WMV、CABYV復合侵染數為，9個樣本為ZYMV、CABYV復合侵染，8個樣本為WMV、ZYMV、CABYV復合侵染。表4

2.5 WMV與ZYMV不同地區分離物間氨基酸序列比較

根據包括新疆吐魯番分離在內的16個來源于不同地區的ZYMV分離物DNA序列推導其蛋白質氨基酸序列并進行序列比對，表明16個分離物NIB蛋白3’端與CP蛋白5’端之間均存在蛋白切割位點Q/S，并且所有分離物CP蛋白N端均存在DAG基序，但是新加坡分離物該基序突變為GAG,法國和以色列分離物該基序突變為DTG。

根據包括新疆吐魯番分離在內的15個來源于不同地區的WMV分離物DNA序列推導其蛋白質氨基酸序列并進行序列比對，表明15個分離物CP蛋白5’端之間同樣存在DAG基序，但除澳大利亞分離物該基序突變為DTG外，其余分離物該基序序列均為DAG。圖6，圖7

表4 鄯善縣黃化類型和畸形花葉類型病毒病樣三種病毒的檢測結果
Table 4 The detection result of yellow types virus disease samples and malformation mosaic types three virus disease samples in Shanshan county

癥狀類型Symptomtype統計項目Statisticalitems樣本數(個)SamplenumberWMVZYMVCABYVWMVZYMV共侵染InfectedbybothWMV、ZYMVWMVCABYV共侵染InfectedbybothWMV、CABYVZYMVCABYV共侵染InfectedbybothZYMV、CABYVZYMVWMVCABYV共侵染InfectedbybothZYMV、WMV、CABYV黃化類型Yellowtype樣本數(個)111010109998侵染比例(%)90.9190.9190.9181.8281.8281.8272.73畸形花葉類型Malformationmosaictype樣本數(個)29251027002侵染比例(%)86.2134.486.9024.140.000.006.90總計Total樣本數(個)40352012169910侵染比例(%)87.5050.0030.0040.0022.5022.5025.00

圖6 ZYMV 不同地區分離物NIB-CP基因氨基酸序列比對
Fig.6 NIB-CP gene amino acid sequence alignment between different ZYMV isolates from different regions

圖7 WMV 不同地區分離物CP基因氨基酸序列比對
Fig.7 CP gene amino acid sequence alignment between different ZYMV isolates from different regions

CABYV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自西班牙、法國、泰國、菲律賓、韓國、日本、烏茲別克斯坦等國分離物的CP基因序列應用MEGA6.06軟件采用近鄰法構建系統發育樹。供試所有28個分離物可分為三個大組，CABYV吐魯番分離物、菲律賓、韓國、日本、烏茲別克斯坦以及包括大部分中國分離物在內的亞洲國家分離物劃分至組Ⅰ，來自泰國的四個分離物及中國云南、廣西的分離物被劃分至組Ⅱ，西班牙、法國、臺灣及菲律賓的分離物被分組Ⅲ。研究獲得的CABYV新疆分離物與來自中國國內省份的分離物親緣關系更近，大部分亞洲國家分離物與歐洲來源分離物間親緣關系較遠，但臺灣與菲律賓部分分離物與歐洲國家分離物親緣關系較近。圖8

WMV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自歐洲、亞洲、中東、北美、南美、澳洲等不同地區具有代表性國家的分離物CP基因序列應用MEGA6.06軟件采用近鄰法構建系統發育樹，結果表明，供試25個分離物可分為四個大組，WMV吐魯番分離物與法國、韓國、阿根廷、日本及大部分中國分離物劃分至組Ⅰ，來自中國新疆西瓜的分離物與意大利分離物單獨劃分至組Ⅱ，伊朗、以色列、西班牙、澳大利亞、土耳其分離物劃分至組Ⅲ，印度、新西蘭、委內瑞拉、美國、智利、湯加分離物劃分至組Ⅳ。研究獲得的WMV吐魯番分離物與來自中國不同省份的分離物間親緣關系最近，同時其與法國、韓國、阿根廷、日本分離物間也具有一定的親緣關系。圖9

注：系統發育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖8 依據28個CABYV分離物CP基因核苷酸序列構建的系統發育樹
Fig.8 The Phylogenetic tree were constructed using nucleotide sequence of CP gene from 28 CABYV isolates

注：系統發育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖9 根據25個WMV分離物CP基因核苷酸序列構建的系統發育樹
Fig.9 The Phylogenetic tree were constructed using according to nucleotide sequence of CP gene from 25 WMV isolates

注：系統發育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖10 根據36個ZYMV分離物NIB-CP基因核苷酸序列構建的系統發育樹
Fig.10 The Phylogenetic tree were constructed according to nucleotide sequence of NIB-CP gene from 36 ZYMV isolates

ZYMV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自亞洲、歐洲、美洲、大洋洲不同國家分離物的NIB-CP基因序列應用MEGA6.06軟件采用近鄰法構建系統發育樹。結果表明，供試36個分離物可被劃分至六個大組，研究獲得的新疆吐魯番分離物XJturufan2與斯洛伐克、捷克、匈牙利、敘利亞、伊拉克、法國、以色列、巴基斯坦、波蘭等歐洲及中東國家分離物與劃分至組Ⅰ，新疆吐魯番分離物XJturufan與中國浙江、河南、聊城、臺灣等地區分離物和美國、西班牙、日本等國分離被劃分至組Ⅱ，中國山西分離物99/193與韓國分離物Cu被劃分至組Ⅲ，中國臺灣THML1、TN3、PT5、TC1等4個分離物、中國浙江杭州P、SG等2個分離物、中國海南HN-01分離物被劃分至組Ⅳ，新加坡與留尼汪島分離物被劃分至組Ⅴ，中國山西BJ-03分離物、中國浙江杭州西瓜、南瓜、甜瓜三種作物來源分離物被單獨劃分至組Ⅵ。研究獲得的兩個分離物均來自新疆吐魯番地區甜瓜，但分屬于兩個不同的組，分離物XJturufan2與來自東歐、中東國家的分離物親緣關系更近，而分離物XJturufan與同屬組Ⅱ的中國浙江、河南、聊城、臺灣等地區分離物和美國、西班牙、日本等國分離物親緣關系更近。劃分的6個組群中，除組Ⅴ不含來自中國的分離物外，其余5組均包含中國分離物，表明ZYMV中國不同地區的分離物間分子變異比較大。圖10

3 討 論

3.1 經調查2014年度吐魯番地區0.066 7×104hm2(1萬多畝)秋茬復播甜瓜病毒病以黃化癥狀和畸形、花葉癥狀兩種癥狀類型為主，兩種癥狀類型的病毒病發病率最高可達100%，但以畸形、花葉癥狀類型病毒病的平均發病率較高。從播種時間與病毒病發病程度相互關系來看，6月復播的甜瓜發病程度明顯重于7月復播甜瓜，發病程度與播種時間存在播種越晚發病程度越輕的趨勢，這種發病規律可能與吐魯番地區甜瓜病毒病傳毒介體傳毒特性、當地不同時間段田間寄主結構變化和氣候條件等多重因素共同作用相關，其病害流行機制需通過進一步試驗研究予以解析。

3.2 研究檢測的40個供試病毒病樣本中，WMV、ZYMV、CABYV侵染比例依次為87.5%、50%、30%，WMV、ZYMV兩種病毒在黃化癥狀和畸形、花葉癥狀的病毒病樣中的侵染比例均很高，因此WMV、ZYMV為吐魯番地區甜瓜病毒病的優勢病毒。CABYV病毒已在全國多數地區均有分布[21, 24]，但是國內相關研究中新疆地區的檢測樣本均來自南疆喀什地區，北疆地區的發生情況尚不明確，研究結果表明，吐魯番地區已有CABYV病毒病發生危害。2014年度采集自吐魯番甜瓜病毒病暴發流行區病毒病樣的檢測結果表明，黃化類型病毒病樣CABYV的侵染比例高達90%以上，畸形花葉類型病樣CABYV的侵染比例也達6.9%，因此CABYV已成為引起吐魯番地區甜瓜病毒病的主要病毒之一。黃化類型病樣中存在嚴重的WMV、ZYMV、CABYV復合侵染情況，上述兩種或兩種以上病毒在黃化類型病樣中復合侵染比例高達70%以上，但是從癥狀來看供試病樣均為黃化，而WMV、ZYMV單獨侵染的情況下甜瓜發病癥狀主要為畸形、皰斑、花葉，因此WMV、ZYMV、CABYV三種病毒間可能存在一定的互作而影響癥狀表現。CABYV是造成黃化癥狀的主要病毒，據調查吐魯番地區部分地塊黃葉癥狀病毒病發病率可達100%，因此CABYV的發生危害應引起種植者的重視。

3.3 ZYMV等馬鈴薯Y病毒屬基因組的翻譯策略是先翻譯一個多聚蛋白,再經自我催化切割成不同的蛋白質。3’端CP蛋白與Nib切割位點一般為Q/G,QS/,Q/A。研究表明ZYMV兩個新疆吐魯番分離物的CP與NIB蛋白之間的切割位點為Q/S,而參與比較的其他國家分離物也表現相同的遺傳特征。

3.4 馬鈴薯Y病毒屬CP基因氨基酸序列中含有一段蚜傳所必需的DAG基序，該基序任意一個氨基酸殘基發生改變，該病毒分離物均會喪失蚜傳能力[25]。研究表明WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物該基序的氨基酸序列同樣為DAG,推測其應具備蚜傳能力。但是參與比較的ZYMV新加坡分離物、法國分離物、以色列分離物及WMV澳大利亞分離物該基序分別突變為GAG、DTG、DTG、 DTG，理論推測上述四個分離物失去蚜傳能力，劉衛榮等[19]也曾報道WMV新疆昌吉分離物該基序突變為DAE，表明不同地區WMV、ZYMV分離物蚜傳特征結構域DAG存在一定的突變頻率，該突變也有可能影響不同地區分離物的致病傳播能力。

3.5 CABYV新疆吐魯番分離物與來自中國國內省份的分離物親緣關系更近，而大部分亞洲國家分離物與歐洲來源分離物間親緣關系較遠，尤其是地理位置較為相近的來自泰國的四個分離物與來自中國云南、廣西的分離物被劃分至一組，上述分析結果表明CABYV不同分離物間的遺傳差異與其地理來源相關。這主要是由于CABYV為非種傳病毒且以蟲傳為主，其相對于其他種傳病毒較難發生快速高頻率的遠距離傳播，不同地理來源分離物間發生病毒基因重組的機率較低。

3.6 WMV、ZYMV吐魯番分離物均與來自中國不同省份的分離物間親緣關系最近，系統進化分析表明兩種病毒不同地理來源分離物間遺傳差異與地理分布間相關性不顯著。供試WMV、ZYMV不同地理來源分離物分別可劃分為4個亞組和6個亞組，表明兩種病毒不同地理來源分離物間分子變異較大。ZYMV除組Ⅴ不含來自中國的分離物外，其余5組均包含中國分離物，表明ZYMV中國不同地區的分離物間分子變異比較大。

4 結 論

吐魯番地區甜瓜病毒病以黃化癥狀和畸形、花葉癥狀兩種癥狀類型為主，兩種癥狀類型的病毒病發病率最高可達100%，但以畸形、花葉癥狀類型病毒病的平均發病率較高。WMV、ZYMV為吐魯番地區甜瓜病毒病的優勢病毒，CABYV已成為引起吐魯番地區甜瓜病毒病的主要病毒之一。ZYMV新疆吐魯番分離物的CP與NIB蛋白之間的切割位點為Q/S，WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物CP基因蚜傳特征結構域DAG基序的氨基酸序列均為DAG。CABYV、WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物與來自國內省份的分離物親緣關系更近。

References)

[1]新疆維吾爾自治區統計局. 新疆統計年鑒[J]. 北京: 中國統計出版社, 2015:383-384.

Statistics Bureau of Xinjiang Uygur Autonomous Region. (2015).XinjiangSurveyYearbook[J].Beijing: China Statistics Press :383-384. (in Chinese)

[2] 王志民，鄭光宇，馮貢澤，等. 侵染哈密瓜的西瓜花葉病毒的血清學鑒定[J]. 植物病理學報,1983,(1):14-22.

WANG Zhi-ming, ZHENG Guang-yu, FENG Gong-ze, et al. (1983). Serological identification of watermelon mosaic virus infected melon [J].ActaPhytopathologicaSinica, (1):14-22. (in Chinese)

[3] 尹玉琦，崔星明，全俊仁，等. 新疆哈密瓜病毒病毒源的分離和鑒定[J]. 植物保護學報,1982,(3):157-162.

YIN Yu-qi, CUI Xing-ming, QUAN Jun-ren, et al. (1982). Isolation and identification of the virus of Xinjiang Hami melon [J].JournalofPlantProtection, (3):157-162. (in Chinese)

[4] 謝浩，趙長生，邱并生. 感染南瓜花葉病毒的哈密瓜種子的ELISA檢測和熱處理[J]. 微生物學通報,1986,(3):100-102.

XIE HAO, ZHAO Chang-sheng, QIU Bin-sheng. (1986). ELISA detection and heat treatment of squash mosaic virus infected melon seeds [J].Microbiol.China. (3):100-102. (in Chinese)

[5] 李國玄，王志民，孫怡，等. 引起哈密瓜壞死的兩種病毒的分離及鑒定[J]. 植物病理學報,1985,(3):165-170.

LI Guo-xuan, WANG Zhi-ming, SUN Yi, et al.(1985). Isolation and identification of two viruses causing Hami-melon necrosis [J].ActaPhytopathologicaSinica, (3):165-170. (in Chinese)

[6] 裴美云，邱并生，謝浩，等. 哈密瓜花葉病毒病的研究-Ⅰ病原學[J]. 植物病理學報,1982,(4): 29-34.

PEI Mei-yun, QIU Bing-sheng, XIE Hao, et al. (1982). Study of Hami melon mosaic virus disease-Ⅰ Etiology[J].ActaPhytopathologicaSinica, (4):29-34. (in Chinese)

[7] 孫怡，徐海燕，畢圻，等. 哈密瓜種子帶毒率檢測及帶毒種子的熱處理效果研究[J]. 植物病理學報,1985,(1):64-65.

SUN Yi, XU Hai-yan, BI QI, et al. (1985). Study on detection of percentage of seeds infected virus and the effect of heat treatment with seeds infected virus [J].ActaPhytopathologicaSinica, (1):64-65. (in Chinese)

[8] 謝浩，孫嚴，危曉薇，等. 感染西瓜花葉病毒2號(WMV-2)的哈密瓜種子帶毒的證實[J]. 植物病理學報,1988,(4):28.

XIE Hao, SUN Yan, WEI Xiao-wei, et al. (1988). The identification on Hami melon seed infected by watermelon mosaic virus 2 (WMV-2) [J].ActaPhytopathologicaSinica, (4):28. (in Chinese)

[9] 鄭光宇，王志民，孫怡，等. 新疆哈密瓜病毒病的免疫電子顯微鏡診斷[J]. 植物病理學報,1984,(1):47-50.

ZHENG Guang-yu, WANG Zhi-ming, SUN Yi, et al. (1984).The diagnosis of Xinjiang Hami melon virus used immune electron microscopy [J].ActaPhytopathologicaSinica, (1):47-50. (in Chinese)

[10] 向本春，尹玉琦，崔星明. 酶聯免疫吸附法檢測哈密瓜(WMV-2)種子及幼苗的帶毒研究[J]. 石河子農學院學報,1985,(2):1-7.

XIANG Ben-chun, YI Yu-qi, CUI Xin-ming. (1985).The study on Hami Melon seed and Seedling infected by (WMV-2) using enzyme linked immunosorbent assay [J].JournalofShiheziAgriculturalCollege, (2):1-7. (in Chinese)

[11] 黃傳賢，覃秉益，奚仲興，等. 從新疆哈密瓜分離到的煙草壞死病毒及其理化性質的研究[J]. 植物病理學報,1984,(3):153-158.

HUANG Chuan-xian, QIN Bing-yi, XI Zhong-xin, et al. (1984). Study on tobacco necrosis virus isolated from Xinjiang Hami melon and its physicochemical properties [J].ActaPhytopathologicaSinica, (3):153-158. (in Chinese)

[12] 李國玄，趙長生，謝浩，等. 新疆哈密瓜病毒類型及分布[J]. 植物病理學報,1986,(3):9-12.

LI Guo-xuan, ZHAO Chang-sheng, XIE HAO, et al. (1986).The types and distribution Hami Muskmelon virus in Xinjiang [J].ActaPhytopathologicaSinica, (3):9-12. (in Chinese)

[13] 吾爾尼沙，李維琪，彭加木. 新疆哈密瓜花葉病病原體的研究-Ⅰ.病毒質粒的分離提純方法[J]. 生物化學與生物物理學報,1980,(3):237-241.

WU Er-ni sha, LI Wei-qi, PENG Jia-mu. (1980). Study on Hami melon mosaic disease pathogen in Xinjiang-Ⅰ. separation and purification method of virus plasmid [J].ActaBiochimicaetBiophysicaSinica, (3):237-241. (in Chinese)

[14] 魏寧生，張滿良，吳云峰，等. 新疆、甘肅甜瓜病毒病的鑒定及防治[J]. 植物保護學報,1991,(1):81-85.

WEI Ning-sheng, ZHANG Man-liang, WU Yun-feng, et al. (1991). Identification and control of melon virus disease in Xinjiang and Gansu [J].JournalofPlantProtection, (1):81-85. (in Chinese)

[15] 鄭光宇，董濤. 在新疆發生的小西葫蘆黃化花葉病毒的研究初報[J]. 植物病理學報,1991,(1):74.

ZHENG Guang-yu, DONG Tao. (1991). The study report on occurrence of Zucchini yellow mosaic virus in Xinjiang [J].ActaPhytopathologicaSinica, (1):74. (in Chinese)

[16] 趙榮樂，鄭光宇. 危害新疆西瓜的一種線狀病毒的研究[J]. 北京師范大學學報(自然科學版),1998,34(2):258-263.

ZHAO Rong-le, ZHENG Guang-yu. (1998). Study on a kind of linear virus infected watermelon in Xinjiang [J].JournalofBeijingNormalUniversity(NaturalScienceEdition), 34(2):258-263. (in Chinese)

[17] 劉衛榮，向本春，韓盛. 新疆小西葫蘆黃化花葉病毒的分子鑒定與序列分析[J]. 西北農業學報,2008,17(4):223-228.

LIU Wei-rong, XIANG Ben-chun, HAN Shen.(2008). Molecular identification and sequence analysis of zucchini yellow mosaic virus in Xinjiang[J].NorthwestAgricultureJournal, 17(4):223-228. (in Chinese)

[18] 趙榮樂. 感染新疆甜瓜的南瓜花葉病毒的鑒定[J]. 喀什師范學院學報,2004,25(3):46-50.

ZHAO Rong-le.(2004). Identification of squash mosaic virus infected melon in Xinjiang [J].JournalofKashiTeacher'sCollege, 25(3):46-50. (in Chinese)

[19] 劉衛榮，向本春. 西瓜花葉病毒2號新疆昌吉分離物外殼蛋白基因核苷酸序列分析[J]. 植物病理學報,2008,38(6):576-581.

LIU Wei-rong, XIANG Ben-chun. (2008).Nucleotide sequence analysis of coat protein gene of Watermelon mosaic virus 2 Xinjiang Changji isolates [J].ActaPhytopathologicaSinica, 38(6):576-581, (in Chinese)

[20] 陳炯，陳劍平. Potyvirus屬成員基因組全序列的簡并引物PCR和RACE擴增方法[J]. 病毒學報,2002,18(4):371-374.

CHENG Jiong, CHENG Jian-ping. (2002).Determination of genome sequence of potyviruses by degenerated PCR and RACE methods [J].ChineseJournalofVirology, 18(4):371-374. (in Chinese)

[21]尚巧霞. 侵染瓜類作物的馬鈴薯卷葉病毒屬病毒的檢測、分布和分子變異研究[D]. 中國農業大學,2009.

SHANG Qiao-xia. (2009).Detection,distributionandmoleculardiversityofcucurbits-infectingpoleroviruses[D]. China Agricultural University, Beijing. (in Chinese)

[22] 何丹，海利力·庫爾班，玉山江·麥麥提，等. 西瓜花葉病毒(WMV)外殼蛋白基因克隆及序列分析[J]. 新疆農業科學,2015,52(10):1 849-1 858.

HE Dan, Haili Kuerban, Yushanjiang Maimaiti, et al. (2015). Coat protein .gene cloning and sequence analysis of watermelon mosaic virus (WMV) in Xinjiang main planting areas [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(10):1,849-1,858. (in Chinese)

[23] 李繼洋，楊渡，韓盛，等. 基于多重RT-PCR技術檢測新疆甜瓜主栽區3種病毒病及其分布[J]. 西北農業學報,2015,(8):123-130.

LI Ji-yang, YANG Du, HAN Shen, et al. (2015). Detection and distribution of three viral diseases in xinjiang melon region based on multiplex rt-pcr technique [J].NorthwestAgricultureJournal, (8):123-130. (in Chinese)

[24] 尚巧霞，向海英，韓成貴，等. 侵染瓜類作物的兩種馬鈴薯卷葉病毒屬病毒在我國的分布檢測[C]//. 中國植物病理學會2008年學術年會論文集: 2008:376.

SANG Qiao-xia, XIANG Hai-ying, HAN Chen-gui, et al. (2008).The distribution and detection of two kinds of viruses which belong to Polerovirus genus infecting cucurbits in China [C]//.Proceedingsofthe2008AnnualConferenceoftheChineseSocietyforplantpathology: 376. (in Chinese)

[25] Atreya, C. D., Raccah, B., & Pirone, T. P. (1990). A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus.Virology, 178(1):161-165.

Fund project:Special fund for innovation and development of scientific research institutions in Xinjiang Uygur Autonomous Region "Study on monitoring and control technology of main diseases in melons in Xinjiang"(2014006)； The fund project for outstanding youth science and technology talents in Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "The study on identification and molecular variation of viruses: Polerovirus and Potyvirus that infect melons in Xinjiang"(xjnky-2012-038)； The open research project for State Key Laboratory of Agricultural Biotechnology "The study on identification and molecular variation of viruses: Polerovirus and Potyvirus that infect cucurbit crops in Xinjiang"(2012SKLAB06-3)

Occurrence and Molecular Identification of Three Kinds of Melon Virus Diseases in Turpan Area, Xinjiang

HAN Shen1，HAN Cheng-gui1，Yushanjiang Maimaiti1，YANG Jun2, YANG Du1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；2.CollegeofAgricultureandBiotechnologyandStateKeyLaboratoryforAgro-Biotechnology/ChinaAgriculturalUniversity;Beijing100193,China；3.DevelopmentResearchCenterforGrapes,MelonsandFruitsofXinjiangUygurAutonomousRegion，ShanshanXinjiang838200,China)

【Objective】 To determine the occurrence situation of WMV, ZYMV, CABYV in Turpan area, and find out genetic differences between these virus isolates from different place.【Method】The Infection proportion of CABYV, WMV, ZYMV that infected melons in Turpan area were determined by the method for molecular detection. The genetic differences between the three kinds of viruses from Turpan and these isolates from different domestic and overseas place was analyzed by the method for sequence alignment and construction of phylogenetic trees.【Result】The positive rates of WMV, ZYMV and CABYV in 40 samples of virus disease in Turpan area were 87.5%, 50% and 30%, respectively. There was a protein cleavage site Q/S between NIB protein 3 'terminal and CP protein 5' ends of ZYMV isolates that were isolated from Turpan and other domestic and foreign places. The acid sequences of aphid transmission characteristic domains DAG motif of WMV isolates isolated from Turpan and other domestic and foreign places are DAG separation. The three viruses were divided into different subgroups according to phylogenetic tree.【Conclusion】WMV, ZYMV were the dominant viruses that infected muskmelon in Turpan area, CABYV has become one of the major virus causing muskmelon virus disease in Turpan area. CABYV, WMV Turpan isolates were closer to the isolates from China's domestic provinces, the ZYMV Turpan isolate XJturufan2 is closer to the isolates from Eastern Europe and the Middle East countries, But ZYMV Turpan isolates XJturufan are closer to the isolates from Zhejiang, Henan, Liaocheng, Taiwan in China and other isolates from The United States, Spain and Japan.

WMV; ZYMV; CABYV; phylogenetic tree; DAG motif

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.009

2016-03-10

新疆維吾爾自治區科研機構創新發展專項資金項目“新疆甜瓜主要病害監測與系統防控技術研究”(2014006)；新疆農業科學院優秀青年科技人才基金項目“新疆甜瓜Polerovirus屬與Potyvirus屬病毒鑒定與分子變異研究”(xjnky-2012-038)；農業生物技術國家重點實驗室開放研究課題項目“新疆瓜類作物Polerovirus屬與Potyvirus屬病毒鑒定與分子變異研究”(2012SKLAB06-3)

韓盛(1981-)，男，河北海興人，助理研究員，碩士，研究方向為瓜類作物病害防治，(E-mail)hanshen_1981@163.com

楊渡(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，研究方向為瓜類作物病害防治，(E-mail)zbsyangdu@ sina.cn

S436.5

A

1001-4330(2016)10-1829-14