金絲桃苷對大鼠腦基底動脈的舒張作用及其作用機制

丁 蘭，陳志武，郭 巖

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◇藥學研究◇

金絲桃苷對大鼠腦基底動脈的舒張作用及其作用機制

丁 蘭，陳志武，郭 巖

目的 研究金絲桃苷(Hyp)對大鼠腦基底動脈舒張作用及可能的作用機制。方法 采用微血管張力測定儀檢測Hyp對血栓素A2受體激動劑(U46619)和KCl預收縮的大鼠腦基底動脈環的舒張作用；研究去內皮、大電導鈣激活鉀通道(BKCa)阻斷劑、蛋白激酶C(PKC)激動劑或抑制劑對其血管舒張作用的影響。結果 Hyp(10-5～10-3mol/L)濃度依賴性地舒張U46619(10-7mol/L)和KCl(60 mmol/L)預收縮的大鼠腦基底動脈(P<0.001)；去除內皮后，Hyp的舒張血管作用減弱(P<0.01)；BKCa阻斷劑(IBTX，10-7mol/L)、PKC激動劑(PMA，3×10-7mol/L)均能抑制Hyp的舒血管作用(P<0.01，P<0.001)；而PKC阻斷劑(Bis-1，3×10-6mol/L)能促進Hyp的血管舒張作用(P<0.05)。結論 Hyp對大鼠腦基底動脈有舒張作用，其作用機制可能與激活BKCa通道、抑制PKC有關。

金絲桃苷；基底動脈；血管舒張；大電導鈣激活鉀通道；蛋白激酶C

腦血管疾病是嚴重威脅人類健康及生存質量的疾病，其中缺血性腦血管疾病占75%～85%，尤其近幾年來，趨于年輕化。因此，對缺血性腦損傷病理分子機制及藥物的研究探索一直是醫學界的重要課題與熱點。金絲桃苷(Hyperin，Hyp)系從錦葵科植物黃蜀葵花朵中提取的一種黃酮醇類化合物,研究[1-2]發現Hyp對抗自由基、拮抗過氧化損傷，減輕腦水腫，降低腦血管阻力、增加腦血流量從而對抗腦缺血。但Hyp對腦血管的舒縮作用及其離子通道機制的研究并不清楚。大電導鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated K+channels, BKCa)廣泛分布在哺乳動物各種組織(不含心肌細胞)中，特別是在血管平滑肌中，BKCa通道是最主要的鉀離子通道之一[3]，并參與血管張力調節、細胞的興奮及代謝調節、細胞內信號傳導等過程[4]。因其能夠調節血管張力，所以BKCa通道是治療高血壓、糖尿病、冠心病及缺血性腦中風等疾病的潛在藥物靶點。有研究[5]顯示蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 在BKCa通道調節血管張力過程中有重要意義。該研究以大鼠腦基底動脈為研究對象，采用血管張力測定技術，探討Hyp對血管張力的影響以及與BKCa通道、PKC的關系，為臨床應用 Hyp治療腦血管疾病提供藥理學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠，雌雄各半，250～300 g，均由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 Hyp(批號：MUST-15082112)購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度98%。二甲基亞砜(DMSO)溶解Hyp現配現用，且DMSO終體積分數低于0.1×10-2對實驗無影響；乙酰膽堿(Ach，批號：064K1209)、DMSO(批號：BCBN8235V)、BKCa通道開放劑NS16199(批號：STBD0427V)、PKC激動劑PMA(批號：SLBH6902V)購自美國Sigma公司；血栓素A2受體激動劑(U46619，批號：5)、BKCa通道阻斷劑IBTX(批號：22A)購自德國TOCRIS公司；PKC阻斷劑Bis-1(批號：D00161187)購自德國Merck Millipore公司。

1.1.3 實驗儀器 微血管張力測定儀(丹麥DMT公司，620M)；PowerLab生物信號采集系統(澳大利亞AD公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械廠)；XTS-20連續變倍體視顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦基底動脈的制備 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭迅速取腦，放入通氧的預冷(4℃)PSS緩沖液中，PSS緩沖液含(mmol/L):NaCl 130, KCl 4.7, KH2PO41.18, MgSO4·7H2O 1.18, NaHCO315, Glucose 5.5, Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt hydrate 0.03, CaCl21。顯微鏡下仔細分離大腦基底動脈，去除血管外周的脂肪和結締組織，將動脈斷離成大約2 mm的環供使用，將兩根金屬絲(40 μm)穿過血管管腔，固定于浴槽內。離體基底動脈環具體的制備、張力的記錄方法、血管活性和內皮完整檢測方法同文獻[6]。

1.2.2 Hyp對U46619或KCl預收縮大鼠腦基底動脈環的舒張作用 在正式實驗前用60 mmol/L KCl預收縮血管，當收縮曲線達到平臺后，用PSS緩沖液沖洗2～3次至基線，15 min后，重復上述實驗步驟，KCl刺激收縮良好的血管方可進行正式實驗。在靜息狀態下向浴槽內加入60 mmol/L KCl或者10-7mol/L U46619預收縮血管，當血管收縮達到平臺后，再向浴槽內累積加入Hyp，使其在浴槽內的終濃度依次遞增為10-5、10-4.5、10-4、10-3.5、10-3mol/L。制作Hyp的對數濃度-血管舒張效應曲線，觀察Hyp對預收縮血管環張力的影響。溶劑對照組用等體積DMSO，對照組不含Hyp，其它與實驗組一致，以排除溶劑對實驗結果的影響。

1.2.3 去內皮對Hyp舒張血管的影響 先用鋼絲在血管腔內來回摩擦幾次去除基底動脈環血管內皮[7]，再向浴槽內加入10-7mol/L U46619使血管收縮，待血管收縮穩定后，依次加入上述濃度的Hyp，觀察去內皮對Hyp舒張U46619預收縮基底動脈作用的影響。

1.2.4 各個阻斷劑或激動劑對Hyp舒張血管的影響 在靜息狀態下，向浴槽中分別加入BKCa阻斷劑IBTX、PKC抑制劑Bis-1、PKC激動劑PMA孵育血管20 min，使其分別在浴管內的終濃度為10-7、3×10-6、3×10-7mol/L。待血管張力平穩后，再加入U46619誘發血管收縮，當血管收縮平穩后依次加入上述梯度濃度Hyp，觀察各個阻斷劑或激動劑對Hyp舒張作用的影響。

2 結果

2.1 Hyp對U46619預收縮大鼠腦基底動脈環張力的影響 Hyp(10-5～10-3mol/L)濃度依賴性的舒張U46619(10-7mol/L)預收縮內皮完整的基底動脈環，Hyp的IC50是7.30×10-4mol/L，Imax是(60.68±6.15)%，等體積DMSO溶劑對照組無明顯的舒張作用，Hyp給藥組與溶劑對照組比較差異有統計學意義(F=195.0，P<0.001)。見圖1。

圖1 Hyp對U46619預收縮基底動脈環的舒張作用

2.2 Hyp對KCl預收縮大鼠腦基底動脈環張力的影響 累加濃度的Hyp(10-5～10-3mol/L)對 KCl(60 mmol/L)預收縮內皮完整的血管環有舒張作用，并呈現濃度依賴性，其IC50為1.28×10-3mol/L，Imax為(44.26±12.95)%，溶劑對照組張力沒有明顯變化，Hyp給藥組的血管舒張作用與溶劑對照組比較，差異有統計學意義(F=98.8，P<0.001)。見圖2。

2.3 去內皮對 Hyp舒張U46619預收縮大鼠基底動脈環作用的影響 與去內皮溶劑對照組相比，去除內皮后Hyp仍能濃度依賴性舒張血管(F=408.8，P<0.01)，其IC50為2.22×10-3mol/L，Imax為(26.66±2.77)%；Hyp在內皮完整組與去內皮組之間的舒張程度差異有統計學意義(F=50.4，P<0.01)。見圖3。

2.4 BKCa通道阻滯劑IBTX對Hyp舒張血管作用的影響 IBTX(10-7mol/L)預孵育大鼠腦基底動脈環后，Hyp對U46619(10-7mol/L)預收縮血管的舒張作用與無IBTX組(Hyp組)相比明顯減弱，差異有統計意義(F=12.2，P<0.01)，其IC50為1.51×10-3mol/L，Imax是(35.09±15.27)%。見圖4。與溶劑對照組相比，BKCa通道開放劑NS1619(5×10-5mol/L)、Hyp(10-3.5、10-3mol/L)能夠顯著舒張U46619預收縮的血管環，差異有統計學意義(F=2.0、80.5、358.6，P<0.001)。NS1619的最大舒張率Imax為(98.10±1.38)%，Hyp(10-3.5、10-3mol/L)的Imax分別是(23.15±6.39)%和(60.14±8.16)%。見圖5。

圖2 Hyp對KCl預收縮大鼠腦血管環的舒張作用

圖3 去內皮對Hyp舒張血管作用的影響

與內皮完整組比較：**P<0.01；與去內皮溶劑對照組比較：△△P<0.01

圖4 IBTX對Hyp舒張U46619預收縮大鼠基底動脈環作用的影響±s,n=7)

圖5 NS1619對U46619預收縮血管環張力的影響與溶劑對照組比較：***P<0.001

2.5 PKC激動劑PMA對Hyp舒血管的影響 PMA(3×10-7mol/L)孵育大鼠腦基底動脈環后，Hyp對預收縮血管的舒張作用減弱(F=290.9，P<0.001)，其IC50是3.07×10-3mol/L，Imax從未加激動劑處理組(Hyp組)的(60.68±6.15)%下降到(19.94±4.13)%。見圖6。

圖6 PMA對Hyp介導的大鼠基底動脈環舒張作用的影響±s,n=7)

2.6 PKC阻滯劑Bis-1對Hyp舒血管的影響 預先孵育PKC阻斷劑Bis-1(3×10-6mol/L)后， Hyp對U46619(10-7mol/L)預收縮腦基底動脈環的舒張作用增強(F=18.1，P<0.05)，其IC50是6.85×10-4mol/L，Imax是(65.73±10.79)%。見圖7。

圖7 Bis-1對Hyp舒張U46619預收縮基底動脈作用的影響

3 討論

腦基底動脈可以顯著影響腦血管阻力，對微血管壓力起到決定性作用，其功能的紊亂可加重缺血性腦損傷，在維持正常腦血液循環中擔任重要角色。本研究利用離體血管舒縮實驗研究Hyp對大鼠腦基底動脈張力的影響，結果顯示60 mmol/L的KCl和10-7mol/L U46619預收縮的大鼠腦基底動脈上，Hyp可以產生濃度依賴性的舒張作用，其舒張腦血管作用可能與內皮、BKCa通道、PKC有關。

Hyp作為一種黃酮醇類單體化合物，研究[1,8]顯示其對多種腦損傷模型有較好的保護作用。血管內皮在調節血管阻力方面有著重要作用，內皮組織釋放血管內皮活性物質，其最終影響血管平滑肌的電生理和舒縮活動。內皮源性血管活性物質包括松弛因子和收縮因子。一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺環素(prostacyclin, PGI2)是有代表性的內皮源性血管舒張因子。實驗表明無論是內皮完整還是去內皮的血管環，Hyp均對其有濃度依賴性的舒張作用，提示Hyp的舒張血管作用， 部分是通過血管內皮實現的，另一部分可能直接作用于血管平滑肌。以往研究[9-10]表明Hyp可以明顯地舒張主動脈或腦動脈，其舒張作用部分依賴于內皮。研究[11-12]顯示腦基底動脈預孵育NO合酶抑制劑L-NAME和PGI2合酶抑制劑Indo后，Hyp的舒血管作用有所減弱，但舒張作用依然存在，說明Hyp舒張作用涉及內皮源性舒張因子如NO、PGI2。這些結果均表明Hyp舒張基底動脈是內皮依賴性的。另外，血管去除血管內皮后，雖然Hyp舒張血管作用明顯減弱，但仍具備一定的舒張功能，提示Hyp對血管平滑肌也有非內皮依賴性的舒張作用。

本實驗主要研究Hyp對腦基底動脈環張力的影響以及與BKCa通道的關系。在血管平滑肌細胞中，鉀離子通道開放導致膜超極化，并進一步引起電壓依賴性鈣離子通道關閉，鈣離子內流減少，最終血管舒張。其中最為重要的是 BKCa通道，因其電導最大，廣泛分布于血管平滑肌，直接參與血管張力的調節，有較大的生理意義。Hyp可誘導大鼠腦血管產生濃度依賴性的舒張作用和血管平滑肌細胞膜的超極化作用，并且這種Hyp對腦血管的舒張效應能夠被非特異性鈣激活鉀通道(KCa)抑制劑TEA所抑制[10-12]，以上結果說明Hyp的舒腦血管作用與KCa通道的激活有關，但涉及到具體哪種KCa通道，尚需要進一步研究。本研究顯示，BKCa阻斷劑IBTX可抑制Hyp的舒血管作用，說明Hyp舒張腦基底動脈作用可能與其激活BKCa通道有關。

調節腦血管平滑肌收縮的胞內信號轉導途徑包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)途徑和蛋白激酶C途徑，PKC可介導血管平滑肌鈣依賴性收縮[13]，尤其腦缺血時，PKC可引起血管平滑肌異常收縮，最終加重缺血損傷，因此PKC在調節血管平滑肌舒縮過程中發揮重要作用。在培養的家兔門靜脈細胞[14]、豬冠狀動脈平滑肌細胞[15]上，PKC的激動劑PMA對KCa通道表現出不同程度的阻斷作用，也有研究[16]表明：在鼠的肺動脈平滑肌細胞上，經由不同的信號轉導途徑，PKC可阻斷BKCa通道的開放；也可激活BKCa通道。以上說明PKC在BKCa通道調節血管張力過程中具有重要意義。本研究顯示，大鼠腦基底動脈預孵育PKC激動劑PMA能夠部分抑制Hyp的舒血管作用，而PKC抑制劑Bis-1卻能夠促進Hyp舒張腦血管。因此，得出這樣的結論，PKC參與Hyp舒血管過程，也就是說Hyp通過抑制PKC舒張腦血管，可能是Hyp經PKC激活BKCa通道，最終導致血管舒張，其具體機制尚需許進一步探討。

綜上所述，Hyp可濃度依賴性地舒張大鼠腦基底動脈，其舒張機制可能與內皮細胞、BKCa通道、PKC有關。

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Vasodilatation and mechanism of hyperin on rat cerebral basilar artery

Ding Lan, Chen Zhiwu, Guo Yan

(DeptofPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveToinvestigatethevasodilatationofhyperin(Hyp)onratcerebralbasilararteryanditsrelatedmechanism.MethodsRatcerebralbasilararteryringswereprecontractedwith9,11-Dideoxy-9a,11a-methanoepoxyprostaglandinF2a(U46619)orKClandthevasodilatationofHyponthearteryringswasrecordedwiththeMultiWireMyographSystemModle,Mechanicalremovaloftheendothelium,Large-conductanceCa2+-activatedK+channels(BKCa)inhibitor.ProteinkinaseC(PKC)activatororinhibitoronthebasilararteryringswereusedtoinvestigatethevasorelaxingmechanismofHyp.ResultsHyp(10-5～10-3mol/L)concentration-dependentlyrelaxedtheendothelium-intactringsprecontractedwithU46619(10-7mol/L)orKCl(60mmol/L)(P<0.001).MechanicalremovaloftheendotheliumproducedasignificantinhibitiononHyp-inducedvasodilatorresponse(P<0.01).Hyp-inducedrelaxationwasattenuateddrasticallybyIBTX(BKCachannelinhibitor, 10-7mol/L)andPMA(PKCactivator, 3×10-7mol/L)(P<0.01,P<0.001),whileBis-1(PKCinhibitor,3×10-6mol/L)promotedtheHyp-inducedvasorelaxation(P<0.05).ConclusionHyprelaxescontractedratbasilarartery.ActivationofBKCaandInhibitionofPKCmaybeinvolvedinunderlyingmechanismofHyp-inducedvasodilatation

hyperin;basilarartery;vasodilatation;BKCachannel;proteinkinaseC

安徽省自然科學基金(編號：1408085MH171)

安徽醫科大學藥理學教研室，合肥 230032

丁 蘭，女，碩士研究生；郭 巖，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:guoyanzx@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.016.html

R 285.5；R 329.251；R 962.1；R 972.4；R 743

A

1000-1492(2016)11-1625-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.016

2016-06-22接收