ILK介導Akt信號通路誘導人晶狀體上皮細胞轉分化的研究

朱玉廣，朱 艷，孫寶琪，陳 晨，李 珺，李 霞

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ILK介導Akt信號通路誘導人晶狀體上皮細胞轉分化的研究

朱玉廣，朱 艷，孫寶琪，陳 晨，李 珺，李 霞

目的 研究ILK抑制劑QLT0267對轉分化人晶狀體上皮細胞(HLECs)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK3β)的影響，探討ILK介導Akt信號通路在HLECs轉分化的作用。方法 選擇傳3代HLECs進行實驗，實驗分三組：TGF-β2組加入含有濃度為100 ng/L的TGF-β2培養基，ILK抑制劑組加入10 nmol/L QLT0267預處理1 h后，再加入濃度為100 ng/L TGF-β2培養基培養48 h，對照組加入無血清培養基。Western blot法檢測HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的變化。采用免疫熒光技術檢測HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt、p-GSK3β的表達。結果 與對照組比較，TGF-β組E-cadherin表達減弱，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達增強，差異有統計學意義。與TGF-β組比較，ILK抑制劑組α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表達明顯減弱，E-cadherin的表達明顯增強，差異有統計學意義(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.001)，QLT0267部分逆轉TGF-β誘導的HLECs α-SMA、p-Akt、p-GSK3β和E-cadherin的表達。結論 ILK介導Akt信號通路參與TGF-β2誘導的HLECs轉分化過程，QLT0267通過特異性結合ILK，影響下游信號的傳導，降低了HLECs的轉分化。ILK介導Akt信號通路可能在后囊膜混濁過程中發揮重要作用。

ILK；Akt信號通路；晶狀體上皮細胞；轉分化；轉化生長因子-β2

白內障是常見的致盲性眼病，后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)是現代白內障術后影響視力提高的主要因素[1]。人晶狀體上皮細胞(human len epithelialcells，HLECs) 的轉分化是PCO 的主要病理改變，轉化生長因子-β2 ( transforming growth factor-β2，TGF-β2) 以誘導HLECs 的轉分化[1-2]。前期研究[3-4]顯示整合素β1參與TGF-β2誘導HLECs轉分化，并且抑制整合素β1的表達可以抑制HLECs轉分化。整合素激活后主要通過整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)發揮核心作用，ILK參與體內多個信號傳導通路，ILK及其信號通道在HLECs轉分化中的作用還未見報道。該研究利用HLECs轉分化細胞模型，探討Akt信號通道在HLECs轉分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人晶狀體上皮細胞HLEC-h3細胞株(上海復蒙基因生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑 兔抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(美國Sigma公司)；兔抗人磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗體、兔抗人磷酸化糖原合酶激酶-3β(p-GSK-3β)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；兔抗人E-鈣黏素(E-cadherin) 單克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)；Recombinant Human TGF-β2(美國R&D Systems公司)；FITC-標記羊抗兔二抗(美國BETHYL公司)；DMEM 細胞培養液、胎牛血清(美國GIBCO公司)；ILK抑制劑QLT0267(加拿大 QLT公司)。

1.3 HLECs的復蘇、培養與傳代 取液氮凍存的HLEC-h3細胞株，放置于37 ℃水浴箱快速解凍，將細胞懸液移到離心管，加入DMEM細胞培養液(含10%胎牛血清)，吹打混勻，離心后棄去上清液，加入細胞培養液，吹打混勻后移到細胞培養瓶內，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每3～4 d換1次DMEM細胞培養液。待HLECs 90%融合后，胰蛋白酶(1 ∶3)消化傳代。選擇傳3代的HLECs進行實驗。

1.4 實驗分組 制作HLECs細胞爬片，待HLECs達80%融合后，24 h血清饑餓培養后分組。分為對照組、TGF-β2組和ILK抑制劑組。對照組加入無血清培養基，TGF-β2組加入含濃度為100 ng/L的TGF-β2培養基，ILK抑制劑組預先加入10 nmol/L QLT0267孵育1 h，再加入濃度為100 ng/L TGF-β2培養基培養48 h后進行后續實驗。

1.5 Western blot法檢測HLECs α-SMA、E-cadherin、p-Akt和p-GSK3β的表達 細胞裂解法冰上裂解細胞提取蛋白，用BCA protein assay reagent測定蛋白濃度并配平，取變性蛋白20 g/孔加入10% SDS-PAGE凝膠進行電泳，恒壓下蛋白轉PVDF膜，脫脂奶粉封閉。分別加入相應一抗α-SMA(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000) 、p-Akt(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶800)，4 ℃孵育搖床過夜。二抗(1 ∶3 000) 室溫孵育1～2 h, PBS-T洗膜，用ECL化學發光試劑盒進行顯色、曝光、顯影并定影。UVP凝膠成像掃描分析系統對膠片條帶進行吸光度(absorbance,A) 測定。

1.6 免疫熒光檢測HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達 取出HLECs細胞爬片，PBS沖洗2次，冷丙酮/甲醇(1 ∶1)固定20 min，10%正常山羊血清封閉1 h，分別加入相應兔抗人單克隆抗體，濕盒內4 ℃孵育過夜，滴加FITC-標記羊抗兔二抗，室溫下避光孵育1 h。滴入20%甘油封片劑封片，熒光顯微鏡(德國Leica公司)觀察并拍照。PBS代替一抗或二抗作為陰性對照。以綠色熒光為陽性表達，比較HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，采用單因素方差分析和t檢驗進行比較。

2 結果

2.1 Western blot檢測結果 Western blot 分析結果顯示TGF-β2明顯抑制E-cadherin的表達，TGF-β2明顯促進α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達。QLT0267能部分逆轉TGF-β2誘導的HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達。HLECs E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達三組比較差異有統計學意義(F=12.325、17.686、8.547、6.812，P<0.05)，見圖1。

圖1 HLECs中E-cadherin、α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的相對表達

2.2 免疫熒光法檢測結果 免疫熒光結果顯示：對照組HLECs E-cadherin在細胞膜上表達較強，ILK抑制劑組HLECs E-cadherin的表達減弱，TGF-β2組HLECs E-cadherin在細胞膜的表達明顯減弱，轉為細胞質或細胞核表達，分布較彌散(圖2)。對照組HLECs α-SMA微量表達，ILK抑制劑組HLECs α-SMA的表達增強，TGF-β2組HLECs α-SMA的表達明顯增強，主要表達于胞質內，并在細胞核周積聚(圖3)。對照組HLECs p-Akt表達較弱，ILK抑制劑組HLECs p-Akt的表達增強，TGF-β2組HLECs p-Akt的表達明顯增強，并向細胞膜聚集(圖4)。與p-Akt的表達類似，對照組HLECs p-GSK3β表達較弱，ILK抑制劑組HLECs p-GSK3β的表達增強，TGF-β2組HLECs p-GSK3β的表達明顯增強，主要在細胞膜表達并聚集，少量彌散于胞質和細胞核(圖5)。

圖2 免疫熒光檢測HLECs E-cadherin的表達 ×400

圖3 免疫熒光檢測HLECs α-SMA的表達 ×400

圖4 免疫熒光檢測HLECs p-Akt的表達 ×400

圖5 免疫熒光檢測HLECs p-GSK3β的表達 ×400

3 討論

白內障是臨床上常見的致盲性眼病，白內障超聲乳化聯合人工晶體植入術是現代白內障治療的最佳手術方式。但由于PCO的發生，引起患者部分視功能喪失。同時，PCO也是現代白內障術后影響視力提高的主要因素之一[5]?，F代白內障手術保留了囊袋，囊袋殘存的HLECs增生是白內障手術后PCO形成的主要原因[6]。研究[7]顯示 HLECs的轉分化是PCO 的主要病理改變。

前期研究[1-2]顯示，TGF-β2可以誘導HLECs 的轉分化。利用TGF-β2可以建立HLECs轉分化細胞模型。利用HLECs轉分化細胞模型，實驗顯示整合素β1參與TGF-β2可以誘導HLECs轉分化，并且抑制整合素β1的表達可以抑制晶狀體上皮細胞轉分化[3-4]。整合素激活后主要通過ILK發揮核心作用[8]，ILK參與體內多個信號傳導通路，ILK及其信號通道在HLECs轉分化中的作用還未見報道。實驗顯示，TGF-β2處理后，培養的HLECs E-cadherin表達減弱，而α-SMA、p-Akt和p-GSK3β的表達增強，而HLECs經10 nmol/L QLT0267預處理后，α-SMA、p-Akt和p-GSK3β表達明顯減弱，E-cadherin的表達明顯增強。說明Akt信號通路參與TGF-β2誘導的HLECs轉分化過程。

ILK是近年發現的絲/蘇氨酸的蛋白激酶，依賴整合素的細胞粘著，通過ILK結合并磷酸化整合素β1亞單位，激活PI3K，磷酸化激活下游底物Akt、GSK-3β[9]，影響胞外信號向下游的傳遞，參與細胞的生長、分化等過程。QLT0267是人工合成的小分子蛋白，能自由地通過細胞膜，特異性結合ILK[10]。本研究顯示，應用QLT0267后，HLECs p-Akt和p-GSK3β的表達明顯下降，說明ILK介導Akt信號通路參與TGF-β2誘導的HLECs轉分化過程，QLT0267通過特異性結合ILK，影響下游信號的傳導，降低了HLECs的轉分化，有可能抑制PCO的形成。QLT0267的作用從側面證實了ILK參與了HLECs的轉分化。

QLT0267部分抑制了TGF-β2誘導的HLECs轉分化，但并沒有完全阻斷，提示可能還有其他的信號通道也參與了TGF-β2誘導的HLECs轉分化過程，這需要進一步的深入研究，以期尋找、干預HLECs轉分化或PCO形成的分子靶點，抑制PCO的產生。

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Effect of Akt signal pathway mediated by ILK in epithelial mesenchymal transition of human lens epithelial cells

Zhu Yuguang,Zhu Yan,Sun Baoqi,et al

(TheEyeCenter,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege,Weifang261031)

ObjectiveTostudytheeffectofQLT0267onexpressionsofE-cadherin,α-SMA,p-Aktandp-GSK3βinhumanlensepithelialcells(HLECs),andinvestigatetheeffectofAktsignalpathwaymediatedbyILKinepithelialmesenchymaltransition(EMT)ofHLECsinducedbyTGF-β2.MethodsTheHLECswereculturedandpassagedin vitro.The3rdgenerationofHLECsweredividedinto3groups.TheHLECsinTGF-β2groupweretreatedwithTGF-β2(100ng/L)forinducementfor48hours.TheHLECsinILKinhibitorgroupwerepretreatedwithQLT0267(10 nmol/L) for 1 hour, then treated with TGF-β2(100 ng/L) for 48 h.The HLECs in the control group were cultured in serum-free medium.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were analyzed by Western blot.The expressions of E-cadherin, α-SMA, p-Akt and p-GSK-3β were detected by cell fluorescence immunoassay.ResultsCompared with the control group, the expression of E-cadherin was decreased significantly, while the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were increased significantly in TGF-β2 group.Compared with TGF-β2 group, the expressions of α-SMA, p-Akt and p-GSK3β were decreased significantly, while the expression of E-cadherin was increased significantly in ILK inhibitor group(F=12.325, 17.686, 8.547, 6.812, allP<0.001). QLT0267 partly reversed TGF-β2 induced expressions of E-cadherin,α-SMA, p-Akt and p-GSK3β.ConclusionThese results suggest that Akt signal pathway mediated by ILK may be involved in the procedure of EMT of HLECs induced by TGF-β2.QLT0267 can specifically bind ILK,and partly inhibit the process of EMT.Akt signal pathway may play an important role in the progress of PCO.

ILK; Akt signal pathway; human lens epithelial cells; epithelial mesenchymal transition; transforming growth factor-β2

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金計劃(編號：BS2009SW016)；山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(編號：2015WS0047)

濰坊醫學院附屬醫院眼科中心，濰坊 261031

朱玉廣，男，副教授，博士； 朱 艷，女，講師，責任作者，E-mail:azhu1975@sina.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.014.html

R 776.1

A

1000-1492(2016)11-1617-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.014

2016-06-27接收