重樓皂苷Ⅰ對低氧喉癌Hep-2細胞增殖和HIF-1α、VEGF表達的影響

鄧碧凡，廖 敏，邱榮敏，高 波，張云桂，馬 燕，龍劍文

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重樓皂苷Ⅰ對低氧喉癌Hep-2細胞增殖和HIF-1α、VEGF表達的影響

鄧碧凡1，廖 敏1，邱榮敏1，高 波1，張云桂1，馬 燕1，龍劍文2

目的 研究重樓皂苷Ⅰ對低氧喉癌Hep-2細胞增殖及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法 采用MTT法檢測重樓皂苷Ⅰ對細胞增殖的影響，實時定量PCR(RT-PCR)法檢測低氧條件下重樓皂苷Ⅰ對Hep-2細胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達的影響。采用Western blot法檢測低氧條件下，重樓皂苷Ⅰ對Hep-2細胞VEGF、HIF-1α、信號傳導與轉錄激活因子3(STAT-3), 磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3(p-STAT-3)蛋白表達的影響。結果 重樓皂苷Ⅰ對低氧喉癌Hep-2細胞的增殖有抑制作用；其中，1.5、3、6 μg/ml濃度組重樓皂苷Ⅰ可下調低氧Hep-2細胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達。同時，重樓皂苷Ⅰ抑制了STAT-3、p-STAT-3的表達。結論 重樓皂苷Ⅰ能抑制低氧條件下喉癌Hep-2細胞增殖和HIF-1α、VEGF的表達，可能與其下調STAT-3表達及抑制STAT-3的磷酸化有關。

重樓皂苷Ⅰ;Hep-2細胞;細胞增殖;HIF-1α; VEGF

喉鱗狀細胞癌為常見頭頸部惡性腫瘤，我國喉癌發病率約占頭頸部腫瘤的13.9%，為全身惡性腫瘤的2.1%[1]。雖然近來喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總的生存率仍然很低。喉癌的綜合治療已成為一種治療趨勢。尋找高效、低毒的抗喉癌藥物十分重要。低氧是實體惡性腫瘤增殖中一種常見現象[2]，缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor 1-α，HIF-1α) 是喉癌腫瘤低氧中的中樞環節，調控相關基因的轉錄[3]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促血管生成因子，目前是抑制腫瘤血管生成的主要靶點[4]。信號傳導及轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT-3)參與腫瘤細胞的增殖，并可以調節HIF-1α和VEGF的表達[5]。重樓是中醫治療腫瘤的常用藥物之一，目前研究[6]表明，重樓有效成分重樓皂苷Ⅰ對某些腫瘤細胞具有抑制作用，但對喉癌腫瘤細胞作用如何，目前暫無報道。該研究觀察重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下喉癌Hep-2細胞增殖活性的影響，以及對低氧Hep-2細胞HIF-1α、VEGF和STAT-3表達的影響，探討重樓皂苷Ⅰ治療喉癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重樓皂苷Ⅰ 粉劑(中國藥品生物制品檢定所)；Hep-2喉癌細胞株[中國科學院(上海)]；100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素和MTT試劑盒(武漢博士德生物公司)；DMEM培養基、小牛血清和胰蛋白酶(美國 Gibco公司)；TRIzol總RNA提取試劑(美國 Invitrogen公司)；Quantonestep RT-PCR試劑盒、SYBR green熒光實時定量PCR試劑盒(北京天根生化公司)；多克隆兔抗VEGF、多克隆兔抗STAT3、多克隆兔抗HIF-1α、多克隆兔抗p-STAT3、β-actin試劑盒(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記抗兔lgG抗體(英國 Abcam公司)；辣根酶標記的β-actin抗體(上海興悠生物科技有限公司)；ECL試劑盒(瑞典 Amersham Biosciences公司)。分光光度儀(芬蘭 Multiskan MS公司)；細胞培養箱(美國 Thermo Electron公司)

1.2 細胞培養 將Hep-2細胞在37 ℃、5% CO2空氣，含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的培養基內培養，在細胞聚集達60%～70%時，置于37 ℃，含1%O2、5%CO2、94%N2的低氧培養箱中繼續培養36 h，提取細胞總RNA及總蛋白。

1.3 MTT法檢測細胞增殖實驗 將Hep-2細胞接種于96孔板(5×104個/孔)，細胞生長至60%～70%融合狀態時，加入重樓皂苷Ⅰ，各組終濃度分別為0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml(預實驗顯示以上濃度對人角質形成細胞無細胞毒作用)，每組6個平行孔，低氧培養36 h，加入20 μl 5 mg/ml MTT，培養4 h，再加入DMSO振蕩，調零，于酶標儀570 nm波長處檢測各組的光密度(optical density, OD)值。細胞生長抑制率(IR)=1-OD1/OD2，OD1表示實驗組細胞OD值，OD2表示空白對照組OD值，實驗重復3次。

1.4 測定低氧條件下重樓皂苷Ⅰ對HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達的影響 Hep-2細胞培養同1.3。設計相關基因上、下游引物，HIF-1α上游引物：5′-CAACCGGTTTAAGGACACATTCTG-3′,下游引物：5′-TCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTG-3′，擴增產物片段長度150 bp；VEGF上游引物：5′-AAGTGGTCCCAGGCTGCA-3′，下游引物：5′-CTCCAGGCCCTCGTCA-3′，擴增長度為216 bp；GAPDH上游引物：5′-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3′,下游引物：5′-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3′，擴增長度為141 bp。提取總RNA，反轉錄合成cDNA；取cDNA 1 μl，加入2.5×RealMasterMix/20×SYBR Solution 11.25 μl，上下游引物各為1 μl，加無Rnase水，反應體積共25 μl；PCR反應條件：95 ℃預變性2 min，循環條件為95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸50 s。采用ΔCt值法計算結果，ΔCt=樣品的Ct均值-內參的Ct均值，2-ΔΔCt即為初始cDNA的相對含量。

1.5 Western blot法檢測 Hep-2細胞培養同1.3，收集細胞，提取細胞總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉l h；PBS洗膜，加一抗(兔抗VEGF 1 ∶500、兔抗STAT3 1 ∶500、兔抗HIF-1α 1 ∶500、兔抗p-STAT3 1 ∶400)，4 ℃過夜；PBS洗膜；加入二抗(辣根酶標記抗兔IgG抗體1 ∶3 000)孵育0.5 h，洗膜，采用ECL試劑盒檢測。以β-actin為內參校正。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，組間均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 MTT法檢測Hep-2細胞的生長活性 低氧條件下培養36 h后，重樓皂苷Ⅰ 6 μg/ml組(t=35.22，P<0.01)、3 μg/ml組(t=21.14，P<0.01)、1.5 μg/ml組(t=9.33，P<0.01)與空白對照組抑制率比較差異有統計學意義；3 μg/ml組(t=12.06，P<0.01)、1.5 μg/ml組(t=23.89，P<0.01)與6 μg/ml組抑制率比較差異有統計學意義。結果表明重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞的生長有抑制作用，其作用具有濃度依賴性。見圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞增殖作用的影響 ×400

A：空白對照組；B～E：重樓皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對照組比較：**P<0.01

2.2 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達的影響 與空白對照組比較, 6 μg/ml組(t=14.89,P<0.01)、3 μg/ml組(t=10.65,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=7.11,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α mRNA表達均有抑制作用。與空白對照組比較，6 μg/ml組(t=17.21,P<0.01)、3 μg/ml組(t=12.84,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=7.83,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞VEGF mRNA表達均有抑制作用。見圖2。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α、VEGF、p-STAT3、STAT3表達的影響 與空白對照組比較, 6 μg/ml組(t=23.97,P<0.01)、3 μg/ml組(t=14.04,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=9.51,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞p-STAT3蛋白表達有明顯抑制作用。與空白對照組比較, 6 μg/ml組(t=8.36,P<0.01)和3 μg/ml組(t=4.33,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞STAT3蛋白表達有明顯抑制作用。與空白對照組比較, 6 μg/ml組(t=23.03,P<0.01)、3 μg/ml組(t=18.58,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=13.21,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α蛋白表達有抑制作用。與空白對照組比較, 6 μg/ml組(t=22.56,P<0.01)、3 μg/ml組(t=13.00,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=9.09,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對低氧Hep-2細胞VEGF蛋白表達有抑制作用。見圖3。

圖2 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達的影響

A：空白對照組；B～E：重樓皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對照組比較：**P<0.01

3 討論

由于喉癌腫瘤組織生長過快，腫瘤細胞往往存在低氧情況。研究[7]顯示，隨著低氧時間的延長，Hep-2細胞計數會逐漸增高。這說明一定程度的低氧會促進喉癌Hep-2細胞的增殖。經過重樓皂苷Ⅰ處理后，抑制了低氧誘導的Hep-2細胞的增殖，提示重樓皂苷Ⅰ具有抑制喉癌腫瘤細胞增殖的活性。以往研究[6]表明重樓皂苷Ⅰ對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并能通過線粒體途徑誘導耐藥性肝癌細胞的凋亡。但在喉癌Hep-2細胞中，重樓皂苷Ⅰ是通過何種途徑發揮抑制作用還需要進一步研究。

圖3 重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下Hep-2細胞HIF-1α、VEGF、 p-STAT3、STAT3蛋白表達的影響

A：空白對照組；B～D：重樓皂苷Ⅰ 1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對照組比較：**P<0.01

研究[8]表明HIF-1α在細胞低氧中發揮重要作用，HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體。在正常情況下，HIF-1α通過羥基化而降解，低氧條件下，HIF-1α羥基化降解被抑制，與HIF-1β組成異源二聚體，轉入核內調節靶基因的轉錄[8]。靶基因包括VEGF、促紅細胞生成素、轉鐵蛋白、內皮素1、誘導型一氧化氮合酶和胰島素樣生長因子等[9]，從而促進腫瘤細胞的生長。VEGF是血管內皮細胞的特異性絲裂原，能夠介導新生血管的形成，在喉癌的生長、侵襲中發揮重要作用[10]。且與喉癌的分化程度、淋巴結有無轉移和TNM分期有關[11]。研究[12]表明重樓皂苷Ⅰ能夠抑制低氧情況下Lewis腫瘤細胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達。本研究也表明重樓皂苷Ⅰ對低氧Hep-2細胞HIF-1α mRNA和蛋白的表達均有抑制作用。

在腫瘤中，各種蛋白激酶的活化已被證實，雖然不同的激酶轉導途徑不同，但STAT3在多數信號通路中發揮重要作用[13]，STAT3蛋白通過上調細胞凋亡抑制基因(如MCL1等)的轉錄和細胞周期調節蛋白(如MYC等)的表達，參與和促進腫瘤的發生[14]。STAT3的活化是許多惡性腫瘤的重要特征[15]。先前的一些研究[5]表明，STAT3對于HIF-1α表達是非常重要的，STAT3抑制劑能下調HIF-1α表達。STAT3也可通過誘導VEGF的產生參與腫瘤進展[16]。STAT3抑制劑能有效抑制VEGF生產與腫瘤血管的形成[5]。 Zhang et al[17]發現STAT3抑制劑AG490能明顯抑制喉癌Hep-2細胞的增殖。本研究結果表明重樓皂苷Ⅰ能夠下調低氧狀態下喉癌Hep-2細胞STAT3的表達，并抑制STAT3的磷酸化。這可能是重樓皂苷Ⅰ抑制低氧喉癌Hep-2細胞增殖和HIF-1α、VEGF表達的原因之一。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ能夠抑制低氧喉癌Hep-2細胞增殖和HIF-1α、VEGF表達，這可能與其下調Hep-2細胞STAT3的表達，并抑制STAT3的磷酸化有關。

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Effect of Polyphylin I on proliferation and expressions of HIF-1α，VEGF in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 under hypoxia

Deng Bifan, Liao Min, Qiu Rongmin, et al

(DeptofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,HezhouPeople′sHospital,Hezhou542899)

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofPolyphyllinIonproliferationandexpressionsofHIF-1α,VEGFinlaryngealcarcinomacelllineHep-2underhypoxia.MethodsMTTassaywasperformedtoinvestigatetheeffectofPolyphyllinIontheproliferationofHep-2cellsunderhypoxicconditions.Real-timequantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofHIF-1αmRNAandVEGFmRNA.WesternblotwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofVEGF,HIF-1α,STAT-3andp-STAT-3.ResultsPolyphyllinIinhibitedHep-2cellsproliferationunderhypoxiacondi-tion.PolyphyllinItreatment(1.5，3，6μg/ml)down-regulatedthemRNAandproteinexpressionsofHIF-1α,VEGFinHep-2cellsunderhypoxia.Meanwhile,PolyphyllinItreatmentinhibitedtheproteinexpressionsofSTAT-3andp-STAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.ConclusionPolyphyllinIinhibitsHep-2cellsproliferationanddown-regulatestheexpressionsofHIF-1αandVEGFinHep-2cellsunderhypoxia.ItmayberelatedtoreducedSTAT-3expressionandinhibitionofthephosphorylationofSTAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.

PolyphyllinI;Hep-2cell;cellproliferation;HIF-1α;VEGF

湖北省衛生計生委中醫藥、中西醫結合科研指導性項目(編號：2013Z-B05)

1賀州市人民醫院耳鼻喉頭頸外科，賀州 5428992湖北中醫藥大學臨床醫學院，武漢 430061

鄧碧凡，男，碩士，副主任醫師，責任作者，E-mail:ljwhbzyy@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.013.html

R 767.1

A

1000-1492(2016)11-1613-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.013

2016-06-15接收